藥用四水碳酸鑭及其雜質堿式碳酸鑭的定性和定量分析

馬雨璇 王 娜 李 鋼

(南京師范大學食品與制藥工程學院, 分析測試中心, 南京 210023)

慢性腎臟病(CKD)的發(fā)病率與日俱增，患者普遍伴隨著鈣磷代謝紊亂問題，腎臟排磷量顯著減少會導致高磷血癥。高磷血癥是維持性血液透析患者死亡的獨立危險因素，已經(jīng)成為慢性腎疾病的常見并發(fā)癥[1，2]。傳統(tǒng)的鋁鹽和鈣鹽磷結合劑由于其毒副作用大，已經(jīng)被棄用。鑭是稀土中的陽離子元素，以三價形式(La3+)存在，對羧基和磷酸基具有較強的親和力，可與磷酸鹽結合形成水溶性低的磷酸鑭難溶物。目前被開發(fā)成藥物碳酸鑭(LC)，于2004年10月由美國FDA批準應用于臨床[3-5]。碳酸鑭主要是通過對細胞內的氧化應激反應進行抑制，激活細胞外信號調節(jié)激酶來達到抑制內皮細胞凋亡的目的[6]。該復合鑭鹽在胃腸道吸收少，主要經(jīng)膽汁排泄，少部分經(jīng)腸道排泄，腎臟排泄甚少，所以對腎病患者不造成腎臟的二次損傷[7，8]。經(jīng)過長期臨床試驗表明，雖然碳酸鑭與碳酸鈣在磷結合率上效用相當，但是長期使用鈣類磷結合劑可導致高鈣血癥，增加血液中的鈣磷乘積以及心血管疾病的患病風險[9-12]，而碳酸鑭不僅可降低血液中的鈣磷乘積，還可以減少高鈣血癥和甲狀旁腺激素相關疾病的發(fā)生。臨床數(shù)據(jù)顯示碳酸鑭耐受性好且副作用少，患者在服用藥物后，血磷水平得到明顯降低，僅少部分出現(xiàn)一些惡心、嘔吐以及便秘的癥狀[13]。與其他磷結合劑相比，碳酸鑭毒副作用小，結合率高，不經(jīng)腎排泄，具有廣闊的市場和良好的前景[8]。

基于現(xiàn)有的相關文獻報道并不多，在國內對該藥物的研究也比較少，需要對其進行深入的研究。碳酸鑭的制作工藝較為復雜，鑭離子為硬路易斯酸，易與氫氧根離子結合，制備時需要控制pH值在酸性條件下，將氯化鑭(LaCl3)溶液倒入碳酸氫鈉(NaHCO3)溶液中形成晶核，再以晶核為中心逐漸擴大形成碳酸鑭結晶，其中以4個結晶水的碳酸鑭(La2(CO3)3·4H2O)結晶生物利用度最高，藥效最好[14]。若制備過程中反應條件控制不當會導致目標碳酸鑭藥物中混有雜質晶型堿式碳酸鑭(LaCO3OH)，而美國FDA從未批準其用于高磷血癥的臨床治療[14]。為了確保藥品質量，需要一種切實有效的方法對La2(CO3)3·4H2O和 LaCO3OH進行定性分析，其中LaCO3OH有I型和II型兩種晶型。對于藥物不同晶型的研究通常借助于X-射線粉末衍射法(PXRD)、熱分析法、傅里葉變換紅外光譜法(FT-IR)、掃描電子顯微鏡法(SEM)，在相關文獻中已有較多報道[15-17]。本研究主要通過上述現(xiàn)代分析手段對La2(CO3)3·4H2O和LaCO3OH的兩種雜質晶型進行表征，建立了定性和定量分析方法，為我國將來仿制藥的生產(chǎn)和質量控制提供保障和科學依據(jù)。

1 儀器與材料

FA2004型電子天平；SHB-3型循環(huán)水式多用真空泵；D/max 2500VL/PC型陽極轉靶X射線衍射儀；JSM-5610型掃描電子顯微鏡；Analysis Diamond熱重分析儀；DHG-9070A(101A-1S)鼓風干燥器；VERTEX70 型傅里葉變換紅外光譜儀。

La2(CO3)3·4H2O和LaCO3OH晶型I、II由南京某公司提供。

2 碳酸鑭樣品的定性和定量分析

2.1 定性分析

2.1.1熱重-差熱分析(TG-DTA)

稱取樣品約2.0mg 放入鉑金坩堝，將坩堝放入 TGA 中進行測試，以氮氣為保護氣，升溫速率為 10 k·min-1，升溫范圍為 25℃～800 ℃，進行熱重分析。

2.1.2傅里葉變換紅外光譜法分析(FTIR)

采用KBr壓片法檢測樣品，掃描范圍4000 ～ 400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32次，用聚苯乙烯膜校正。

2.1.3掃描電子顯微鏡法分析(SEM)

取樣品粘結在樣品座上，鍍膜處理后放置于掃描電子顯微鏡下觀察形態(tài)結構。測定條件：加速電壓8kV，放大倍率2000，樣品臺直徑30mm。

2.1.4X-射線粉末衍射法分析(PXRD)

測定條件為管壓：40kV, 管流：100 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接收狹縫(RS) = 0.15 mm。掃描速度:5°·min-1，連續(xù)掃描，掃描范圍3°～ 40°，步寬：0.02°。

2.2 定量分析

2.2.1實驗方法

單峰法[17]。

2.2.2X-射線粉末衍射法分析(PXRD)

測定條件為管壓：40kV；管流：150 mA，Cu-Kα輻射，石墨彎晶單色器，發(fā)射狹縫(DS)=防散射狹縫(SS)=1°，接收狹縫(RS) = 0.15 mm；掃描速度:1°·min-1；步進掃描，掃描范圍10°～ 30°；步寬：0.02°。

2.2.3檢測限和定量限

利用檢測限(LOD)和定量限(LOQ)兩個指標來測試峰面積法和峰高法的靈敏度[18]。計算公式見式(1)和式(2)：

LOD=3.3σ/S

(1)

LOQ=10σ/S

(2)

式中σ為標準誤差，使用的是標準曲線截距的標準誤差；S為標準曲線的斜率。實驗中使用origin軟件對標準曲線(峰面積法和峰高法)進行計算和分析。

3 結果分析

3.1 定性分析

3.1.1熱重-差熱分析

圖1為四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的熱重分析圖譜(A: La2(CO3)3·4H2O、B: LaCO3OH-I、C: LaCO3OH-II)。四水碳酸鑭在高溫下分解主要分為3個步驟，如式(3)：

La2(CO3)3·4H2O → La2(CO3)3→ La2O2CO3→ La2O3

(3)

如圖1A所示，四水碳酸鑭樣品在25～350℃發(fā)生第一步分解，失去4個結晶水分子，失重比例為17.0%，放出熱量141.8J；在350～600℃發(fā)生第二步分解反應，失去2個CO2分子，失重比例為17.1%，放出熱量281.9J；在600～800℃發(fā)生第三步分解反應，失去最后1個CO2分子，失重比例為7.9%，放出熱量540.3J，最后的剩余樣品為La2O3。其三步的熱重損失比例測量值與理論計算值基本一致，說明該樣品確為四水碳酸鑭，符合其高溫分解式。

堿式碳酸鑭晶型I和II的高溫分解式分為兩步，如式(4)和(5)：

2LaCO3OH → La2O2CO3+ H2O + CO2

(4)

La2O2CO3→ La2O3+ CO2

(5)

如圖1B所示，堿式碳酸鑭晶型I在310～590℃階段發(fā)生第一步分解反應，失去1個H2O分子和1個CO2分子，失重比例為16.1%，放出熱量382.1J；在590～800℃發(fā)生第二步分解反應，失去1個CO2分子，失重比例為9.3%，放出熱量1190.0J。該失重測量值與理論計算值基本一致，符合式(4)和式(5)的分解式。

如圖1C所示，堿式碳酸鑭晶型II在340～580℃階段發(fā)生第一步分解反應，同樣也是失去1個H2O分子和1個CO2分子，失重比例為17.6%，放出熱量561.8J；第二步分解反應發(fā)生在580～800℃時，失去 1個CO2分子，失重比例為9.8%，放出熱量722.7J。堿式碳酸鑭晶型II的熱重損失量符合理論計算值和分解式。

3.1.2傅里葉變換紅外光譜分析

圖2為四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的FTIR圖(A：La2(CO3)3·4H2O、B: LaCO3OH-I、C: LaCO3OH-II)，表1為堿式碳酸鑭中各官能團的紅外特征吸收。由于堿式碳酸鑭中還含有-OH，除了歸屬CO32-的特征峰以外還應該含有可歸屬于OH的特征峰位置。

圖2A中各個吸收峰：3259cm-1處的寬峰為四水碳酸鑭中結晶水的O-H伸縮振動和H-O-H彎曲振動所引起的；1470 cm-1和1365 cm-1處歸屬于CO32-基團的伸縮振動；849cm-1、747cm-1和677cm-1處歸屬于CO32-基團的變形振動。

根據(jù)文獻[19]可知，堿式碳酸鑭晶體中CO32-的四個吸收峰主要是在1070～1100 cm-1(ν1)、850～880 cm-1(ν2)、1400～1510 cm-1(ν3)和690～730 cm-1(ν4)處。

圖2B中各個吸收峰：1499 cm-1和1435 cm-1處的尖峰可歸屬于ν3，1080 cm-1可歸屬于ν1，848 cm-1和872cm-1兩個吸收峰歸屬于ν2，而70 cm-1處的特征峰歸屬于ν4，它們均是由樣品中的CO32-基團的變形振動所引起的；3616 cm-1、3485 cm-1處的尖峰歸屬于自由OH的伸縮振動，590 cm-1處的尖峰歸屬于OH的彎曲振動。以上的吸收峰均是由堿式碳酸鑭晶型I中的各個官能團所引發(fā)的特征吸收，可作為其鑒別的特征峰。

如圖2C所示，1488 cm-1和1421 cm-1處的尖峰可歸屬于ν3，1074 cm-1可歸屬于ν1，858 cm-1和808 cm-1兩個吸收峰歸屬于ν2，而725 cm-1和697 cm-1處的特征峰歸屬于ν4，它們也是由樣品中的CO32-基團的變形振動所引起的；3450 cm-1處的尖峰由自由OH的伸縮振動引起，未看見低波數(shù)區(qū)的彎曲振動。這些吸收峰均是由于堿式碳酸鑭晶型II中的各個官能團所引發(fā)的特征吸收，同樣也可用作其鑒別的特征峰。

表1 堿式碳酸鑭晶型I和II的紅外數(shù)據(jù)

圖2 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的紅外分析圖A. 四水碳酸鑭; B.堿式碳酸鑭晶型I ; C.堿式碳酸鑭晶型II

堿式碳酸鑭晶型II相比于晶型I，其官能團所引起的吸收特征峰沒那么復雜，少了兩個自由OH的吸收峰(3616cm-1處OH的伸縮振動和590 cm-1處OH的彎曲振動)。可能是由于晶型結構不同，晶型II中CO32-吸收的貢獻占據(jù)主要部分，其峰強度更高。從圖表中也可以看出堿式碳酸鑭晶型II中的CO32-的特征吸收更強、特征峰更清晰尖銳。

3.1.3掃描電子顯微分析

四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II樣品的掃描電鏡微形貌如圖3所示(A：La2(CO3)3·4H2O、B：LaCO3OH-I、C：LaCO3OH-II)。圖3A可以看出四水碳酸鑭的微觀形貌為片層狀；圖3B顯示堿式碳酸鑭晶型I的微觀形貌是大小均勻的顆粒狀；圖3C是堿式碳酸鑭II其微觀形貌為團聚在一起大小不一的絮狀。

圖3 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的掃描電鏡圖A. 四水碳酸鑭; B. 堿式碳酸鑭晶型I ; C. 堿式碳酸鑭晶型II

3.1.4X-射線粉末衍射分析

從圖4中可以看出，LaCO3OH的I型和II型與La2(CO3)3·4H2O各自有不同的特征峰。La2(CO3)3·4H2O(A)在2θ=13.4°、18.32°、19.66°、22.92°、23.92°、27.04°和30.34°處有特征峰，2θ=13.4°處為最強峰；LaCO3OH的I型(B)在2θ=17.62°、24.3°、30.22°和35.78°處有特征峰，2θ=30.22°處為最強峰；LaCO3OH的II型(C)在2θ=15.68°、20.26°、20.64°、23.58°、23.9°、26.1°、29.8°、31.84°、33.5°、35.37°、36.54°和37.82°處有特征峰，2θ=29.8°處為最強峰。結果與PDF卡片基本一致，誤差在±0.2°范圍內，可據(jù)此來鑒別3種晶型。同時，不同的特征峰也可作為LaCO3OH的I型和II型與La2(CO3)3·4H2O定量分析的基礎，表2～表4中加粗部分代表后續(xù)定量分析3種晶型所選取的特征峰結構數(shù)據(jù)。

圖4 四水碳酸鑭、堿式碳酸鑭晶型I和II的X射線衍射圖A. 四水碳酸鑭; B.堿式碳酸鑭晶型I ; C. 堿式碳酸鑭晶型II

表2 四水碳酸鑭的PXRD數(shù)據(jù)

表3 堿式碳酸鑭晶型I的PXRD數(shù)據(jù)

表4 堿式碳酸鑭晶型II的PXRD數(shù)據(jù)

3.2 定量分析

將制備好的碳酸鑭和LaCO3OH-I和II樣品分別過200目篩，使粒徑盡量保持一致便于充分混合減少粒徑所引起的實驗誤差。然后將樣品放置于干燥器中平衡24小時。通常采用研磨混合的方法來對樣品進行混合。在混合前，采用干法分別對碳酸鑭和兩種堿式碳酸鑭晶型研磨5min、10min和20min，用X射線衍射法對其進行定性檢測，結果表明，3種晶型在不同時間研磨后均未發(fā)生晶型和物相變化，可以此作為定量分析的基礎標樣開展后續(xù)實驗。

在本實驗中，首選干法研磨混合的方法來配制用于定量分析的二元混合物實驗樣品，按照表5中所示比例(總量300mg)分別于分析天平上稱取LaCO3OH-I、II型和La2(CO3)3·4H2O樣品，配制不同比例混晶體系。再置于瑪瑙研缽中研磨混合20min，分別編號N1～N15和M1～M15。將配好的混合樣品靜置在干燥器中，備用。

表5 不同比例的碳酸鑭與堿式碳酸鑭的二元混合體系 %

續(xù)表5

由上面的定性分析可知，La2(CO3)3·4H2O的特征峰為13.40°，LaCO3OH-I的特征峰為17.62°，LaCO3OH-II的特征峰為26.10°。將按表5制備好的混合樣品(N1～N15,M1～M15)在相同的實驗條件下進行測定。比例相同的樣品制樣3次，測定3次，取3次測試結果的平均值作為最終結果。對測試得到的結果分別采用峰高法和峰面積法進行積分，結果如圖5和圖6所示。雜質LaCO3OH-I的峰高標準曲線方程(A)為y = 0.35865x + 0.03026 ，峰面積標準曲線方程(B)為y= 0.12872x+ 0.0072，R2分別為0.95163和0.98431。雜質LaCO3OH-II的峰高標準曲線方程(A)為y= 0.48405x+ 0.01432 ，峰面積標準曲線方程(B)為y= 0.12774x+ 0.00724，R2分別為0.98661和0.98933。由此可得出結論：兩種雜質的定量分析中，峰面積法的線性關系均優(yōu)于峰高法。

堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測限和定量限如表6所示，其中采用峰高法計算出堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測限和定量限分別為3.06%、9.28%和1.32%、4.01%，峰面積法計算出堿式碳酸鑭Ⅰ和Ⅱ的檢測限和定量限分別為1.71%、5.19%和1.18%、3.58%，由此可以看出，建立兩種雜質晶型的標準曲線都是峰面積法更為靈敏。

圖5 LaCO3OH-I與 La2(CO3)3·4H2O二元混合物的強度比與含量的關系曲線A.峰高法; B. 峰面積法

圖6 LaCO3OH- II與 La2(CO3)3·4H2O二元混合物的強度比與含量的關系曲線A.峰高法; B.峰面積法

表6 堿式碳酸鑭晶型Ⅰ和Ⅱ的檢測限和定量限

為了驗證標準曲線的準確度，配置了不同比例的LaCO3OH-I、LaCO3OH-II與四水碳酸鑭的混合樣品(7%、10%和16%)，在相同的實驗條件下進行測定，將所得數(shù)據(jù)按同樣的方法計算出強度比，再分別代入相應的標準曲線方程，結果如表7所示。采用峰高法作出的LaCO3OH晶型I的標準曲線準確度在77.82%～84.13%，峰面積法的準確度在87.09%～94.51%；采用峰高法作出的LaCO3OH晶型II的標準曲線準確度在83.59%～91.36%，峰面積法的準確度在88.35%～97.37%。由此可見，兩種晶型均為峰面積法得出的標準曲線準確度高于峰高法。

表7 不同比例的堿式碳酸鑭晶型I和II的準確度計算值

4 討論

近年來，藥物的晶型研究已經(jīng)成為國內藥物開發(fā)和原研藥仿制的重要內容之一，同種藥物可能存在著不同的晶型，導致藥物療效和生物利用度的不同。對藥物晶型進行結構表征成為臨床用藥的前提，也是藥物穩(wěn)定性考察的基礎和依據(jù)。因此，在對藥物藥理作用研究前必須建立一系列系統(tǒng)的表征方法，以確保該生產(chǎn)藥物是目標藥物。本實驗主要通過熱重分析(TGA)、傅里葉變換紅外光譜分析(FTIR)、掃描電子顯微分析(SEM)和X射線粉末衍射分析(PXRD)等現(xiàn)代分析手段對樣品進行表征，為藥物的定量分析提供參考依據(jù)。

本實驗在對四水碳酸鑭及其兩種雜質晶型堿式碳酸鑭定性分析的基礎上，建立了基于PXRD單峰法中峰高法和峰面積法的定量分析方法。通過選取3種晶型的特征峰來計算峰高強度比和峰面積強度比，分別得出了兩種堿式碳酸鑭雜質在目標晶型中含量的定量標準曲線，兩者都有良好的線性關系，且峰面積法優(yōu)于峰高法。在X射線衍射的定量分析中，通常每個物相我們選取一條特征衍射峰來采集數(shù)據(jù)。該衍射峰和其它物相的衍射峰不可發(fā)生重疊，盡可能選擇獨立且強度較高的特征峰，另外制樣時還要避免擇優(yōu)取向等原因造成強度不穩(wěn)定、出現(xiàn)偏差的現(xiàn)象。本實驗采用的是干法研磨的手段，在對二元體系進行研磨混合時，力度要適中，重在混合而非用力研磨，否則會導致樣品粘附在瑪瑙研缽壁或者研磨棒上，造成數(shù)據(jù)不準確，偏離真實值，甚至破壞晶型。由于LaCO3OH-I和LaCO3OH-II的含量較低，應一邊研磨混合一邊少量多次加入到La2(CO3)3·4H2O中，這樣可以避免雜質樣品結塊，集中在同一區(qū)域從而造成較大實驗誤差。