乙型肝炎病毒e抗原定量檢測的性能驗證和臨床應用探索

郭藝飛，胡堯，蔣祺蓉，黃銘穎，劉愛平，張繼明

1. 復旦大學附屬華山醫院感染科，上海 200040； 2. 復旦大學附屬華山醫院檢驗科，上海 200040

乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)由HBV 前C區或C區編碼而成，經由內質網-高爾基體結構分泌至胞外。HBeAg既不是HBV顆粒的結構成分，也不是HBV DNA復制所必需的，但是發生HBeAg血清學轉換是免疫控制的指標，也是評估慢乙肝治療療效的重要指標。此外，血清HBeAg的水平反應了病毒的復制水平，且HBeAg對于維持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的慢性感染至關重要。血清HBeAg與HBV DNA定量之間有顯著相關性，即HBeAg陽性的患者絕大多數表現出HBV DNA陽性[1]。有研究表明，HBeAg陽性孕婦生產的子女即便接受了乙肝疫苗以及免疫球蛋白的阻斷，相較于HBeAg陰性孕婦所生的子女而言，依舊具有較高的概率發生突破性HBV 感染[2]。《亞太地區慢性乙型肝炎(CHB)治療指南2012》里明確指出，HBeAg和HBV DNA均是乙肝患者監測的常規檢測項目[3]。2015年3月發布的WHO首部全球慢性乙肝指南里也強調了定期監測慢性乙肝患者HBeAg指標的必要性[4]。盡管目前已有大量臨床研究驗證了HBeAg定量檢測對臨床診療的重要性，HBeAg的定量檢測還未成為常規檢驗項目。為了將HBeAg定量檢測應用于臨床，本研究對HBeAg定量檢測平臺進行了性能驗證，評估了定量檢測和定性檢測結果的相關性，并對慢性乙肝患者樣本進行HBeAg定量檢測，觀察其與血清HBV DNA水平、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)等結果的相關性，為HBeAg定量檢測在臨床診療的應用提供實驗依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料

標本來源為2019年3月至2019年5月來本院就診的710例慢性乙型肝炎患者的血清。710例乙肝患者的HBeAg定性檢測均為陽性，男性患者488例，女性患者222例，平均年齡(37.54±11.31)歲。根據血清學、病毒學和生物化學等檢測結果有明確臨床診斷的有98名患者，其中，78名患者處于免疫清除期，20名患者處于免疫耐受期[5]。關于98名患者的基線信息具體如表1所示。本研究經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準(編號：KY2015-212)。

1.2 方法

1.2.1 HBeAg定量檢測分析性能驗證本實驗室首次使用雅培ARCHITECT HBeAg定量試劑在美國雅培ARCHITECT i4000SR全自動免疫分析儀上進行檢測。因此，參照美國臨床實驗室標準化協會(CLSI)相關指南文件EP10A3，對HBeAg定量檢測系統的精密度、分析靈敏度、線性范圍/可報告范圍、攜帶污染率進行分析和驗證，來評估其檢測性能是否滿足實驗室的常規使用要求。驗證期間，已確認儀器運轉良好，質控在控。

1) 精密度驗證實驗

取兩個濃度的質控品作為驗證材料連續檢測5天，各濃度每天重復測定5次。每濃度水平獲得25個數據。若計算的精密度小于等于廠商聲明的質量要求，則驗證通過。

表1 98名有明確臨床診斷患者的基線資料

2) 分析靈敏度驗證實驗

將ARCHITECT HBeAg定量手工稀釋液作為“0”濃度樣品，連續測定20次，重復測定已知濃度樣本(0.7 PEIU/mL)3次，記錄“0”濃度和已知濃度測定結果的相對光單位(relative light unit, RLU)值。如果計算的分析靈敏度≤廠家聲明，則驗證通過。

3) 線性范圍

廠商聲明的線性范圍是1～700 PEIU/mL，取已知濃度的患者高值(H)、低值(L)標本各一份(高值標本濃度為696 PEIU/mL，低值標本濃度為2 PEIU/mL)。將L和H按照如下方式進行配比：5L+0H，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，0L+5H，組成6份驗證物質。測定該驗證物質濃度，每份重復測定2次。線性可允許系統誤差要求 ≤1/2 TEA，TEA=25%。

4) 攜帶污染率

取高濃度樣本(H)和低濃度樣本(L)各一份，將高濃度樣本分成10份，低濃度樣本分成11份，21份樣本按順序：L1-L2-L3-H1-H2-L4-H3-H4-L5-L6-L7-L8-H5-H6-L9-H7-H8-L10-H9-H10-L11連續測定。攜帶污染 =High-Low的均值-Low-Low的均值，即(L4+L5+L9+L10+L11)/ 5-(L2+L3+L6+L7+L8) / 5，攜帶污染 < 3 倍Low-Low的SD則驗證通過。

1.2.2HBeAg定性測定

本實驗室HBV血清標志物檢測常規采用美國雅培ARCHITECT i4000SR全自動免疫分析儀以及乙型肝炎病毒e抗原測定試劑盒。患者血清樣本經實驗室常規HBeAg定性檢測之后，結果判定陽性標準為HBeAg S/CO 值≥1.0，HBeAg S/CO 值<1.0 為陰性。

1.2.3HBeAg定量測定

取HBeAg定性檢測結果判定為陽性的患者樣本，采用美國雅培ARCHITECT i4000SR全自動免疫分析儀、乙型肝炎病毒e抗原測定試劑盒和乙型肝炎病毒e抗原校準品。HBeAg定量檢測結果以Paul Ehrlich institute單位(PEIU/mL)表示。

1.3 HBV DNA定量測定

取HBeAg定性檢測為陽性的患者樣本，采用美國Applied Biosystems公司的7500 Real Time PCR System和上海科華公司的乙型肝炎病毒核酸測定試劑盒。質控品來自上海市臨床檢驗中心。HBV DNA陽性標準：HBV DNA>5×102Copy/mL。

1.4 統計學處理

HBeAg定量檢測的性能驗證數據采用EP Evaluation @軟件(Release11)進行分析。HBeAg定量和定性檢測、HBeAg定量和HBV DNA定量檢測結果的分別比對，采用MedCalc(version 19.1)統計軟件進行統計分析，利用配對T檢驗和Passing-Bablok回歸分析比較兩種方法檢測結果的相關性。P<0.05被認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HBeAg定量檢測的性能驗證

精密度驗證計算低值均值為1.335 PEIU/mL，批內精密度為2.7%，小于說明書宣稱的5.25%，總精密度為5.2%，小于說明書中的7.04%，驗證通過；精密度高值均值為99.387 PEIU/mL，高值批內精密度為1.5%，小于說明書的3.03%，總精密度為4.7%，小于說明書中的5.58%，驗證也通過。靈敏度驗證的數據經統計計算得靈敏度為0.014 PEIU/mL，小于廠商聲明的0.02 PEIU/mL，驗證通過。線性范圍/可報告范圍驗證結果經統計分析，線性驗證誤差(error)為7.0%，小于線性可允許系統誤差12.5%，且在檢測的0～619.520 PEIU/mL范圍內成線性，驗證通過。攜帶污染率數據經統計評估為0.010，符合廠家聲明和本院要求，驗證通過。因此，經過驗證，ARCHITECT HBeAg定量檢測系統的精密度、分析靈敏度、線性范圍、攜帶污染率均符合需求。

2.2 HBeAg定性和定量檢測比對分析

性能驗證顯示HBeAg定量檢測在0～619.520 PEIU/mL范圍內成線性，因此選取HBeAg定量檢測值在線性范圍內的樣本共618例來對比分析HBeAg定量和定性的檢測結果。兩種方法的檢測結果均取Log10之后用對數值做統計分析。配對t檢驗顯示HBeAg定量和定性檢測方法的相關性良好(r=0.997，P<0.000 1)，如圖1所示。Passing Bablok 回歸分析的回歸方程為y=-1.064+1.167x(r=0.997，P<0.000 1，95%CI=0.997～0.998)，顯示相關性良好, 具體如圖2所示。

圖1 HBeAg定性和定量檢測的相關性

圖2 Passing Bablok 回歸分析HBeAg定量和定性檢測的一致性

2.3 HBeAg定量和HBV DNA的關系

選取126例同時定量檢測了HBeAg和HBV DNA的樣本，運用Passing and Bablok回歸分析兩種方法的相關性，回歸方程為y=2.909+1.590x(r=0.363，P<0.000 1，95%CI=1.009～3.765)，顯示HBeAg定量與HBV DNA定量檢測水平呈明顯的正相關，由表中統計可知，隨著HBeAg定量水平的升高，處于高病毒載量的人群占比越來越高(見表2和圖3)。

表2 HBeAg定量檢測和HBV DNA定量檢測的關系[n(%)]

圖3 Passing-Bablok 回歸分析HBeAg定量和HBV DNA定量檢測的相關性

2.4 不同HBeAg定量水平與病毒學指標、血清生化學指標的關系

在98名有明確臨床診斷的患者中選取有HBV DNA檢驗數據的57名患者，根據HBeAg定量水平分為 0.1～1.3 PEIU/mL，1.3～20 PEIU/mL，20～250 PEIU/mL，≥250 PEIU/mL 4組, 由表中數據統計可知，隨著HBeAg定量檢測值的逐漸升高，HBV DNA 病毒載量結果也相應增加。當HBeAg定量高于250 PEIU/ml時，可檢測的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST異常率顯著降低(92.31%降至50.00%)(見表3)。

表3 不同HBeAg定量水平下病毒學和血清生化學指標的特點

3 討論

隨著醫療研究的進展和醫療技術的不斷進步, HBV血清學標志物的檢測從定性檢測進步到了定量檢測[6-12]，定量檢測使得一些乙肝血清學指標有了新的臨床意義和應用，如HBsAg定量檢測已經被納入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，為乙肝診療個體化提供了新的依據[4]。近年來，關于HBeAg定量檢測與慢性乙型肝炎治療療效的相關研究越來越多。一項關于接受干擾素治療的HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者的回顧性研究，對比了HBV DNA和HBeAg對于治療后6個月HBeAg血清學轉換的預測價值，發現：在干擾素治療24周時，HBeAg、HBV DNA水平均可預測治療后6個月的持久應答，且HBeAg比HBV DNA能更好地預測HBeAg的血清學轉換；HBeAg水平在干擾素治療24周處于低中值(<100 PEIU/mL)時，其預測價值和HBV DNA沒有明顯差別，但是水平處于高值(>100 PEIU/mL)時，HBeAg的預測值遠高于HBV DNA(96% vs 86%)。這項研究結果表明血清HBeAg的定量檢測可以用來補充或者部分替代HBV DNA作為HBeAg陽性乙肝患者干擾素治療監控的指標[13]。慢性乙型肝炎患者治療過程中的HBeAg定量水平變化，也是預測核苷(酸)類似物(nucleoside/nucleotide analogues, NAs) 治療反應的有效工具。一項前瞻性研究納入76例HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者接受96周核苷(酸)類似物治療，分別于治療前、治療后12周、24周定量監測血清HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)、 HBeAg、乙型肝炎核心抗體(hepatitis B core antibody, HBcAb)、HBV DNA和ALT的水平，結果顯示治療24周的HBeAg指標下降水平和幅度可用來預測病毒學應答和血清轉換[14]。

HBeAg是診斷有無HBV感染和傳染性的常用血清標志物。目前臨床主要應用酶免疫法或化學發光法來檢測HBeAg，判斷陰陽性，用于輔助診斷HBV的感染狀態[15-17]。HBeAg定性檢測相較于定量檢測具有檢測快速、經濟等優點，在篩查乙型肝炎患者中發揮了重要作用，但是在評估及預測HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者治療療效方面差于定量檢測。近年來，隨著免疫技術的發展和應用，HBeAg定量檢測已經成為臨床研究常用的指標。HBeAg和HBV DNA一起被納入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，作為判斷HBV治療轉歸的標志。本實驗室驗證了雅培ARCHITECT i4000SR全自動免疫分析儀最新的HBeAg定量檢測分析性能，驗證結果表明HBeAg定量檢測的精密度、分析靈敏度、線性范圍、攜帶污染率均符合廠家說明書和本實驗室的要求。通過對比慢性乙型肝炎患者HBeAg定性和定量兩種檢測方法的結果，發現這兩種檢測方法具有良好的相關性。本研究也驗證了HBeAg定量檢測結果和HBV DNA的檢測結果呈正相關且當HBeAg定量≥250 PEIU/ml時，可檢測的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST異常率顯著降低(92.31%降至50.00%)。基于HBV DNA與HBeAg的定量檢測結果的相關性，可由HBeAg定量結果對HBV DNA進行初步預測，并且當HBeAg≥250 PEIU/ml時，ALT或AST的異常率顯著降低，ALT或者AST水平與肝臟的炎癥活動密切相關，對臨床診斷和治療有一定的指導意義。綜上所述，HBeAg可以用于實驗室的常規檢測來為臨床乙型肝炎患者診療提供依據。