紋帶棒狀桿菌耐藥特征研究

魏孔嬌，王嘉正，邱小彤，徐帥，朱雄，李歡，王曉霞，王成玲，范仕弘，韓李超，劉志國, 李振軍,

1. 西藏大學醫學院，西藏自治區 拉薩 850000； 2. 山東第一醫科大學第一附屬醫院(山東省千佛山醫院)檢驗醫學科，山東省醫藥衛生臨床檢驗診斷學重點實驗室，山東 濟南 250000； 3. 中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京 102206； 4. 海南省三亞市人民醫院檢驗科，中心實驗室，海南 三亞 572000

棒狀桿菌屬(Corynebacterium)是一類無芽孢，大多數菌株為無動力的革蘭染色陽性桿菌，主要寄生在人的鼻腔、咽喉、眼結膜、外陰、皮膚等部位。一般無致病性，通常被認為是皮膚和黏膜的正常菌群[1-2]。然而，近年來已有大量研究表明棒狀桿菌存在潛在致病力，特別是紋帶棒狀桿菌(Corynebacteriumstriatum,Cs)，為多種院內感染的病原體，如敗血癥[1]、呼吸道感染[2-3]等。紋帶棒狀桿菌作為條件致病菌，它的多重耐藥性特征使其成為一種院內感染病原體，且在免疫力低下人群中的感染率日趨增高[2-6]。為了解我國紋帶棒狀桿菌的藥物敏感性特征，本研究對2017年3月—2020年6月山東省某三甲醫院臨床分離的83株紋帶棒狀桿菌進行抗菌藥物敏感性檢測，并探討其耐藥機制，期望為該菌的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器與試劑主要儀器：生化培養箱(山東博科生物產業有限公司)、B2生物安全柜(北京東聯公司)、恒溫金屬浴(北京大龍興創實驗儀器股份有限公司)、基因擴增熱循環儀(西安天隆科技有限公司)、電泳儀(美國伯樂公司)，超微量分光光度計(德國Lmplen公司)，實時熒光定量PCR儀(西安天隆科技有限公司)。主要試劑：哥倫比亞血平板(英國OXOID公司)，核酸染料Gold View(北京索萊寶科技有限公司)，細菌基因組DNA、RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]，TB Green? Premix Ex TaqTMⅡ (日本TAKARA公司)，四環素鹽酸鹽、紅霉素鹽酸鹽(上海YEASEN公司)，所有試劑均按說明書指定條件保藏并在有效期內使用。藥敏板購自上海星佰生物技術有限公司，均在有效期內使用并按產品說明書保存。耐藥基因檢測引物設計如表1所示，由北京天一輝遠生物技術有限公司合成。

1.1.2 菌株本研究收集的83株實驗菌株來源于山東某三甲醫院2017年3月—2020年6月分離的紋帶棒狀桿菌(已剔除重復菌株)。在哥倫比亞血瓊脂平板上35 ℃過夜培養，并用16SrDNA進行擴增，擴增產物送北京睿博興科生物技術有限公司進行測序，用blast進行序列比對。細菌基因組DNA提取嚴格按照TIANGEN生物公司試劑盒說明的方法進行，并采用紫外分光光度計進行檢測，制備好的DNA于-20 ℃保存備用。

表1 實驗用引物設計

1.2 方法

1.2.1 藥物敏感性檢測根據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性實驗執行標準[10]，采用微量肉湯稀釋法檢測83株紋帶棒狀桿菌對12種常用藥物的敏感性，按照CLSI的標準，判定菌株對每種藥物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration, MIC)范圍，確定MIC50、MIC90值。肺炎鏈球菌ATCC49619和大腸埃希菌ATCC25922作為質控菌株，標準菌株由中國疾病預防控制中心提供。以2016年M45-ED3(CLSI)文件[10]作為折點判斷標準，確定12種抗生素的MIC值。所有實驗操作均在P2級生物安全實驗室完成。

1.2.2 耐藥基因檢測采用PCR對四環素抗性核糖體保護蛋白基因(tetW)、核糖體甲基化酶基因(ermX)、喹諾酮類藥物耐藥基因(gyrA)、3種氨基糖苷類修飾酶基因[aph(3”)-Ⅰb、aph(6)-Ⅰd、aac(6’)-Ⅰb]進行檢測。PCR總反應體系25 μL：2ΧPCR Master 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL，DNA模板1 μL。PCR反應中使用到的引物信息如表1所示。5 μL PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在紫外燈下觀察結果。陽性產物送北京睿博興科生物技術有限公司測序，測序結果用blast進行比對分析。

1.2.3 基因表達差異分析檢測采用微量肉湯稀釋法檢測3株紋帶棒狀桿菌的最低抑菌濃度(見表6)，在不同濃度的紅霉素、環丙沙星作用下，對ermX和tetW基因的表達進行干預。在哥倫比亞血平板上接種紋帶棒狀桿菌，35 ℃過夜培養后取單菌落置于液體腦心浸液肉湯BHI培養基，37 ℃，180 r/min過夜培養。將菌液以1∶100轉接于20 mL液體BHI，每種藥物接種3管，其中1管不加藥物作為對照，其余2管分別加入該菌株的50% MIC、25%MIC濃度的該藥物，37 ℃，180 r/min過夜培養。5000 r/min離心10 min，棄上清，之后用去離子水洗3次。按照細菌總RNA 提取試劑盒說明方法提取細菌的總RNA，按照逆轉錄試劑盒說明方法將RNA逆轉錄為cDNA，隨后按照熒光定量試劑盒說明推薦方法進行PCR擴增。PCR反應體系：2ΧSYBR Green 10 μL；上、下游引物各0.4 μL；Rox Reference Dye II 0.4 μL；滅菌蒸餾水6.8 μL；模板2 μL。擴增條件具體如下。擴增曲線：95 ℃預變性20 s，95 ℃變性10 s，54 ℃退火34 s。溶解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。采用公式2-ΔΔCt計算基因相對表達量差異倍數。

2 結果

2.1 菌株基本情況

經16S rDNA擴增及序列分析顯示，實驗菌株均為紋帶棒狀桿菌。83株紋帶棒狀桿菌樣本來源及分布病區如表2、表3所示。

2.2 藥敏實驗

83株紋帶棒狀桿菌對12種抗生素的敏感性結果如表4所示。紋帶棒狀桿菌對萬古霉素、利奈唑胺100%敏感，對紅霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)、環丙沙星(MIC50>32 μg/mL、MIC90>32 μg/mL)、克林霉素(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)均表現出完全耐藥，對青霉素、頭孢噻肟、美羅培南的耐藥率分別為97.6%、95.2%、92.8%，對四環素的耐藥率為86.7%，對慶大霉素的耐藥率為38.6%，對多西環素和利福平的耐藥率最低，分別為13.3%和6.0%。

表2 83株紋帶棒狀桿菌樣本來源

表3 83株紋帶棒狀桿菌病區分布

2.3 耐藥基因檢測

83株菌均檢測到喹諾酮類藥物耐藥基因(gyrA)；ermX基因的檢出率為100%；在四環素耐藥菌株中，tetW基因的檢出率為88%；在慶大霉素耐藥的菌株中，aph(3”)-Ⅰb基因的檢出率為36.1%、aph(6)-Ⅰd基因的檢出率為37.3%、aac(6’)-Ⅰb基因的檢出率為15.7%。具體結果如表5所示。

2.4 耐藥基因的相對表達量分析

熒光定量PCR結果表明，在不同濃度的紅霉素、四環素的作用下，ermX和tetW基因的相對表達量差異倍數結果如表6所示。ermX和tetW基因的相對表達量均有所變化，但變化不明顯。部分擴增產物溶解曲線如圖1所示，候選基因的溶解曲線均為單峰，說明所設計的引物特異性良好。

表4 83株紋帶棒狀桿菌藥敏判定結果

表5 耐藥基因檢測結果(n=83)

表6 不同藥物濃度下ermX和tetW基因相對表達量差異倍數

A: secA; B: ermX; C: tetW.

3 討論

本研究從醫院臨床標本中獲得了83株紋帶棒狀桿菌(Cs)，其中ICU病區的最多，占比48%(40株)；從痰液標本中獲得了44株(53%)。Verroken 等[3]在進行流行病學分析時發現，當在醫院發現1株新的紋帶棒狀桿菌時，至少會有1名患者被收入ICU病區或是呼吸道感染科室，而本研究中ICU病區有27例的臨床診斷是呼吸道感染，結果與文獻報道類似。本研究的菌株是否來自同一克隆群，進一步的分子流行病學分析將提供重要的線索。

藥物敏感性分析表明，83株紋帶棒狀桿菌均為多重耐藥菌株，而來自北京、廣東、河北唐山地區醫院的分離菌株的多重耐藥率分別為88.8%、100%、97.3%[8]。此外，重慶地區醫院分離菌株同樣表現出100%多重耐藥率[11]。本研究中的菌株對紅霉素、環丙沙星、克林霉素表現出完全耐藥，對萬古霉素、利奈唑胺表現出完全敏感，這與在河南地區某醫院分離的紋帶棒狀桿菌有相似的耐藥譜[12]，同樣的情況也出現在內蒙古地區[13]。這和國外的情況亦類似[1, 3, 14-17]，例如：2010—2014年從日本醫院分離的24株紋帶棒狀桿菌對萬古霉素(MIC50為0.5 μg/mL、MIC90為 0.5 μg/mL)完全敏感，對喹諾酮類藥物(MIC50>16 μg/mL、MIC90>16 μg/mL)完全耐藥，對克林霉素(MIC50>8 μg/mL、MIC90>8 μg/mL)也表現出完全耐藥[1]；2011年1月—8月在美國倫敦醫院分離的24株紋帶棒狀桿菌也表現出了相似的耐藥譜，對紅霉素、克林霉素耐藥，對萬古霉素敏感[3]。

通常，雙歧桿菌和棒狀桿菌對紅霉素類耐藥是由菌株的染色體攜帶ermX基因所致[18]。本研究中對紅霉素和克林霉素耐藥的菌株均檢測到ermX基因，提示紋帶棒狀桿菌攜帶的核糖體甲基化酶基因使紅霉素作用靶點的核糖體蛋白甲基化，從而降低藥物作用，這是紋帶棒狀桿菌對紅霉素耐藥的潛在機制。50%MIC、25%MIC紅霉素作用濃度對ermX基因的表達無顯著影響，提示耐藥菌株對紅霉素的耐藥方式屬于內在型耐藥[19-20]，無論誘導劑存在與否，核糖體甲基化酶基因(ermX)都可持續而穩定的表達。

楊雪靜等[18]的研究發現，紋帶棒狀桿菌對四環素的耐藥性主要與tet基因簇有關。本研究中除1株對四環素耐藥的菌株未檢測到tetW基因，其余耐藥菌株均擴增到了tetW基因。測序結果與耐藥質粒Pja144188的tetW基因相似度為99%。研究發現，在50%MIC、25%MIC四環素濃度作用下，tetW基因的表達無顯著變化，推測tetW基因編碼核糖體保護蛋白繼而對四環素等產生耐藥性是一個穩定表達的過程，并不會因為藥物是否存在而改變其表達。

本研究對山東地區分離的83株紋帶棒狀桿菌進行了藥物敏感性、耐藥機制檢測。結果顯示，該地區的紋帶棒狀桿菌有較廣的耐藥譜和耐藥基因攜帶率。這將為后續的紋帶棒狀桿菌耐藥流行病學研究及院內感染防控提供參考，而對于紋帶棒狀桿菌的耐藥機制還須進一步研究。