小麥烷基間苯二酚對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗改善作用及機制

郝一銘，楊子慧，劉 潔，王子元，王 靜

(北京工商大學 中加食品營養與健康聯合實驗室，北京 100048)

肥胖伴隨的慢性低度炎癥加速巨噬細胞對脂肪組織的浸潤，加速脂肪組織脂質分解，導致機體胰島素抵抗[1]。肥胖人群脂肪組織中的脂肪細胞和巨噬細胞相互作用，促進巨噬細胞活化為炎性巨噬細胞(M1)，進而提高促炎細胞因子分泌，如白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)等[2]。炎性巨噬細胞分泌的促炎性細胞因子會導致胰島素受體底物-1(IRS-1)發生降解，從而損傷脂肪細胞的胰島素敏感性[3]。胰島素受體底物-1/磷酸肌醇3-激酶/Akt(IRS-1/PI3K/Akt)是受胰島素調節的一條重要分子信號通路，IRS-1的降解可能影響IRS-1/PI3K/Akt通路下游葡萄糖轉運蛋白4(GLUT4)的表達[2-3]。作為調控葡萄糖吸收的關鍵蛋白，GLUT4表達的下調最終導致脂肪細胞葡萄糖攝取的阻斷[4]。此外，脂肪組織在炎癥環境下發生脂質分解，釋放更多游離脂肪酸，導致肥胖人群的血漿游離脂肪酸水平普遍較高[5-6]，而血漿中游離脂肪酸含量的升高會進一步引發機體的胰島素抵抗[7]。

流行病學研究表明，全谷物膳食可降低肥胖、2型糖尿病、心血管疾病的病發和死亡風險[8-11]。全谷物的健康功效歸因于其麩皮中含有的功能活性成分，例如膳食纖維及多酚等植物化學素。烷基間苯二酚(alkylresorcinols，ARs)是存在于小麥和黑麥中一種酚類類脂，在每克小麥麩皮中約含有300～1 500 μg[12]。已有研究表明，60%的ARs進入人體后會被小腸吸收，因此常被作為全谷物膳食的重要生物標志物[13]。近年來，ARs作為重要的全谷物活性功能成分，被報道具有抗氧化[14]、抗炎[15]、神經保護[16]等多種生物活性。Zhu等[13,17]發現，ARs可以有效抑制結腸癌細胞的生長，并且不同烷基鏈長度的ARs之間的抑制活性具有差異；Oishi等[18]的研究表明，高脂飼料中添加質量分數為0.4%的ARs，能夠改善高脂飲食導致的小鼠胰島素抵抗。本團隊前期研究發現，ARs通過抑制NF-κB和JNK/MAPK信號通路，可以抑制脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥因子表達[15]；ARs通過Akt依賴的Nrf2/HO-1信號通路，可以保護ARPE-19細胞免受氧化應激損傷[14]；ARs主要活性單體AR-C17可以通過調節SIRT3/SOD2信號通路改善APP/PS1轉基因小鼠的認知障礙和神經炎癥[16]。

近年來的研究表明，人體脂肪組織中的ARs含量可達到883～1 142 pmol/g，因此ARs在人體脂肪中的含量被作為檢測人們長時間進食全谷物膳食的生物標志物[19]。目前，關于ARs對于脂肪細胞的健康效應尚不清楚，ARs是否可以改善肥胖導致的脂肪細胞胰島素抵抗作用的機制尚未見報道。本研究擬通過建立體外模擬炎癥誘導的脂肪細胞胰島素抵抗模型，評價小麥ARs對于脂肪細胞脂質分解和葡萄糖利用的改善作用，進一步解析其改善脂肪細胞胰島素抵抗的分子作用機制并明確其活性單體，希望為全谷物膳食抑制肥胖及由肥胖導致的胰島素抵抗提供基礎理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

十七烷基間苯二酚(AR-C17)、十九烷基間苯二酚(AR-C19)、二十一烷基間苯二酚(AR-C21)、二十三烷基間苯二酚(AR-C23)和二十五烷基間苯二酚(AR-C25)標準品，購自美國Sigma-Aldrich公司；濟麥22號小麥麩皮中ARs制備方法及含量測定參考文獻[15]中方法，其中ARs各主要組成單體質量分數依次為：AR-C17，1.5%；AR-C19，20.8%；AR-C21，58.2%；AR-C23，9.0%和AR-C25，10.5%。3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(IBMX)、地塞米松、胰島素、LPS、噻唑藍(MTT)、PI3K抑制劑(LY294002)，購自美國Sigma-Aldrich公司；Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)高糖培養基、小牛血清(NBCS)、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素、0.25% 胰蛋白酶，購自美國Gibco公司；甘油含量檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；葡萄糖吸收轉運熒光探針(2-NBDG)吸收試劑盒，購自美國BioVision公司；磷酸化Akt(Ser473)多克隆抗體、Akt多克隆抗體、GLUT4多克隆抗體、β-actin多克隆抗體，購自武漢ABclonal公司；3T3-L1和RAW 264.7細胞系，購自美國ATCC。所有其他化學品和溶劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

GEN5型多功能酶標儀，美國Bio-Tek公司；IX73型熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；HF90型二氧化碳生化培養箱，上海力康公司；ChemiDoc成像系統、Mini-Trans-Blot全能型蛋白轉印系統，美國Bio-Rad公司；YJ-VS-1型超凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術有限公司；5427R型低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；Mini-Protean型蛋白電泳儀，美國伯樂公司。

1.3 實驗方法

1.3.1炎癥誘導培養基制備

RAW 264.7巨噬細胞采用DMEM與體積分數為10%的FBS培養基，并置于37 ℃、體積分數為5%的CO2環境中培養。將RAW 264.7細胞按照2×105個/mL接種于細胞培養皿上，培養24 h后進行分組。設置對照組和LPS炎癥誘導組。對照組:更換新鮮的正常培養基，繼續培養24 h;炎癥模型組:更換含有1 μg/mL LPS的正常培養基，誘導細胞炎癥反應24 h[20]。收集巨噬細胞上清液培養基，分別作為空白培養基和炎癥誘導培養基。

1.3.23T3-L1前脂肪細胞誘導分化與處理

細胞分化流程參照文獻[21]，具體操作方法：3T3-L1細胞采用DMEM與體積分數為10%的NBCS培養基，置于37 ℃、體積分數為5%的CO2環境中培養。按照融合度60%將3T3-L1細胞接種到培養板中，用生長培養基(DMEM+10% NBCS)培養至細胞完全融合，繼續培養2 d讓細胞產生接觸抑制。加入誘導液Ⅰ(高糖DMEM+10% FBS，10 μg/mL胰島素，1 μmol/L地塞米松，0.5 mmol/L IBMX 的培養液)培養2 d后，替換為誘導液 Ⅱ(高糖DMEM+10% FBS，10 μg/mL胰島素培養液)，繼續培養2 d，最終換成高糖培養基(DMEM+10% FBS)培養2 d，即得到分化成熟的脂肪細胞。分化成熟的脂肪細胞分別加入5、10、20 μmol/L的ARs及20 μmol/L ARs各單體化合物(AR-C17、AR-C19、AR-C21、AR-C23、AR-C25)處理24 h，換炎癥誘導培養基處理24 h,再分別檢測各指標。細胞模型及分組情況見表1。

表1 脂肪細胞模型的構建Tab.1 Construction of adipocyte model

1.3.3細胞活力檢測

分化成熟的3T3-L1脂肪細胞加入終濃度為5、10、20 μmol/L的ARs培養基作用24 h；更換等體積的含0.5 mg/mL MTT的新鮮培養基，并在37 ℃、體積分數為5%的CO2環境下繼續培養4 h；去除上清液后，用1 000 μL二甲基亞砜溶解沉淀結晶紫，使用酶標儀在490 nm處測量吸光值。

1.3.4PI3K抑制劑干擾處理

3T3-L1前脂肪細胞分化成熟后，加入ARs處理24 h，換含有1 μmol/L LY294002的新鮮培養基處理24 h，吸取上清液后，PBS清洗2次，換炎癥誘導培養基CM處理24 h，檢測脂質分解及葡萄糖吸收指標。

1.3.5脂肪細胞葡萄糖吸收與脂質分解檢測

通過檢測2-NBDG熒光強度評價細胞葡萄糖吸收水平。3T3-L1成熟脂肪細胞經過不同處理后，收集細胞上清培養液，通過檢測甘油含量測試脂質分解程度。根據2-NBDG吸收試劑盒操作說明，將葡萄糖攝取增強劑按照體積比1∶100加入到DMEM培養基中，細胞繼續更換含有100 μg/mL 2-NBDG的DMEM(含葡萄糖攝取增強劑)培養基，培養30 min，吸取上清液，PBS清洗2遍后，采用質量分數為4%的多聚甲醛溶液固定細胞0.5 h，并用DAPI溶液染色5 min。脂肪細胞葡萄糖吸收能力用脂肪細胞在激發/發射波長465/540 nm (2-NBDG)與358/461 nm (DAPI)處的熒光強度比值表示，并與NC組進行歸一化。

1.3.6油紅O染色

3T3-L1成熟脂肪細胞經過不同處理后，移除上清液，并用PBS洗滌3次。采用體積分數為4%的多聚甲醛溶液固定細胞1 h，移除甲醛溶液并用PBS再次清洗兩遍。采用體積分數為60%的異丙醇媒染15 s，油紅O試劑染色30 min。終止染色后移除染液，用體積分數為60%的異丙醇洗滌15 s去除多余的油紅O試劑。用PBS清洗3次后顯微鏡觀察并拍照，每孔加入1 000 μL異丙醇，震蕩5 min洗出油紅O。每孔取200 μL洗出油紅的異丙醇溶液，轉移至96孔板中，于490 nm處測定吸光值。

1.3.7蛋白質印跡實驗

3T3-L1脂肪細胞經過不同處理后，采用RIPA(radio immunoprecipitation assay)裂解液[含1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)]抽提脂肪細胞總蛋白，12 000 r·min-1離心20 min，收集細胞裂解上清液。BCA法測定細胞裂解液總蛋白濃度，95 ℃變性蛋白。采用質量分數為12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白各個條帶，每個泳道蛋白樣品上樣量為60 μg。SDS-PAGE分離結束后，將蛋白條帶轉移至硝酸纖維素膜(NC)分離，采用質量分數為5%脫脂奶粉的Western洗滌緩沖液(TBST)室溫封閉1 h，4 ℃過夜孵育目的蛋白抗體(按體積比例1∶1 000稀釋anti-GLUT4、anti-p-Akt、anti-Akt和anti-β-actin)。將NC膜用TBST清洗3次，采用Alexa 488 標記的山羊抗兔IgG(按體積比例1∶10 000稀釋)二抗，室溫孵育1 h。采用成像系統分析蛋白條帶熒光值。

1.4 數據處理

實驗均重復3次，采用Graphpad Prism 8.0和SPSS 22.0軟件進行數據處理。實驗結果以平均值±標準偏差表示，組間比較采用One-way ANOVA和Duncan后比較分析，不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 ARs對3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗的影響

ARs對炎癥誘導的脂肪細胞糖脂代謝的影響，實驗結果見圖1。由圖1(a)可知，5～20 μmol/L ARs未對脂肪細胞產生毒性影響。進一步建立脂肪細胞胰島素抵抗模型，研究5～20 μmol/L ARs對脂肪細胞葡萄糖吸收與利用的保護作用。由圖1(b)可知，與空白組相比，炎癥誘導下3T3-L1脂肪細胞2-NBDG攝取水平顯著降低了43.0%(P<0.05)；同時，ARs(5～20 μmol/L)可以劑量依賴性地提高3T3-L1脂肪細胞糖吸收水平。用5、10、20 μmol/L ARs處理的3T3-L1脂肪細胞，顯著增加了炎癥誘導下的2-NBDG攝取量，分別較CM炎癥誘導組提高了4.3%、10.2% 和24.0%，表明ARs對炎癥誘導的脂肪細胞糖脂代謝紊亂具有保護作用。脂肪細胞脂質過度分解通常被視為機體產生胰島素抵抗性的主要原因[22]。有研究表明，炎癥引發的脂解作用會誘導大量的游離脂肪酸的產生，從而進一步破壞細胞胰島素信號，最終導致胰島素抵抗性的發生[23-25]。由圖1(c)和(d)可知：炎癥誘導的脂肪細胞脂質含量與NC組相比降低了32.3%，而甘油釋放量顯著增加了86.5%，表明炎癥導致脂肪細胞脂質分解；20 μmol/L ARs 顯著逆轉了炎癥造成的脂肪細胞脂質含量和甘油釋放紊亂(P<0.05)，進而抑制了脂肪細胞脂質分解。

不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖1 ARs對炎癥誘導的脂肪細胞糖脂代謝的影響Fig.1 Effect of ARs on glucose and lipid metabolism of adipocytes under inflammatory stress

顯微鏡觀察脂肪細胞油紅O染色結果見圖2。由圖2可知，經炎癥誘導培養基處理后，3T3-L1脂肪細胞中的脂滴形態出現明顯減小，而AH組脂肪細胞中的脂滴形態恢復至正常情況。3T3-L1脂肪細胞中的油紅O觀察結果與圖1中的細胞脂質含量和甘油釋放量結果相一致，說明ARs顯著改善了炎癥導致的3T3-L1脂肪細胞脂解作用。研究結果表明，ARs是通過改善炎癥引發的脂肪細胞脂解，來緩解胰島素抵抗，進而維持脂肪細胞正常生理功能的[23]。

2.2 ARs對3T3-L1脂肪細胞糖吸收相關蛋白表達水平的影響

不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖3 ARs對脂肪細胞糖吸收關鍵蛋白Akt及GLTU4表達水平的影響Fig.3 Effect of ARs on expression level of glucose uptake related protein Akt and GLUT 4 from adipocytes under inflammatory stress

進一步解析ARs在改善炎癥引發的脂肪細胞胰島素抵抗中的保護作用機制，采用Western Blot對胰島素調控糖吸收相關通路蛋白進行定量分析，實驗結果見圖3。由圖3可知，當炎癥培養基誘導脂肪細胞胰島素抵抗后，細胞內GLUT4和p-Akt蛋白表達水平與NC組相比顯著降低了39.7%和46.1% (P<0.05)。GLUT4和p-Akt是胰島素信號通路調節糖吸收的主要蛋白[26-28]，其中p-Akt調控GLUT4向細胞膜轉移并提高葡萄糖吸收利用[26]；同時，PI3K/Akt是多種活性物質改善胰島素抵抗作用和提高糖吸收的重要信號通路[25]。有報道證實，富含酚類物質的小麥粉可以通過p-Akt途徑顯著改善肥胖大鼠的胰島素抵抗[29]；同樣，本研究發現，經過20 μmol/L的ARs處理后的脂肪細胞內GLUT4和p-Akt蛋白表達水平與CM組相比顯著提高了35.9%和42.6%(P<0.05)。本研究結果顯示，ARs可能是通過激活p-Akt/GLUT4 信號通路而提高糖吸收水平，改善胰島素抵抗的。

2.3 ARs通過激活p-Akt/GLUT4信號通路對脂肪細胞糖脂代謝改善分析

蛋白條帶圖和油紅O染色圖中的A、B、C、D、E、F分別為NC、CM、AH、NC+LY294002、CM+LY294002、AH+LY294002組。不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖4 LY294002抑制ARs保護脂肪細胞糖脂代謝作用分析Fig.4 Analysis of LY294002 inhibition on protective effects of ARs on glucose and lipid metabolism

為了探討ARs對于脂肪細胞胰島素抵抗保護作用是否特異性激活Akt信號通路，本研究采用LY294002作為PI3K抑制劑，通過抑制PI3K活性以降低p-Akt的蛋白表達水平來進行驗證，實驗結果見圖4。由圖4(a)至圖(c)可知，采用PI3K抑制劑(LY294002)預處理脂肪細胞后，細胞內p-Akt的表達水平及其下游GLUT4蛋白表達受到顯著抑制。ARs對于細胞p-Akt及GLUT4的表達提高被顯著逆轉；同時，有研究表明，p-Akt表達受到抑制后，胰島素改善的脂解作用也被削弱[30]。本研究對LY294002干預后的脂肪細胞脂質積累進行分析，探討ARs激活的p-Akt/GLUT4通路是否參與到ARs對脂肪細胞脂質積累紊亂的保護作用。
圖4(d)結果顯示，LY294002干擾下AH組脂肪細胞中的脂質積累低于AH組。研究結果說明，隨著p-Akt/GLUT4通路表達的降低，ARs改善的脂肪細胞脂質積累保護效果受到限制。抑制劑對于脂肪細胞葡萄糖吸收的影響結果表明，ARs提高3T3-L1脂肪細胞的2-NBDG攝取水平也受到LY294002的顯著抑制[圖4(e)，P<0.05]。本研究發現，ARs除了通過抑制脂肪細胞脂解改善糖吸收能力，還能夠通過激活p-Akt/GLUT4介導的糖吸收抑制脂解。谷物中的多種植物化學素已被證實可以通過激活PI3K/Akt/GLUT4信號通路提高糖吸收水平，改善胰島素抵抗[31-34]。Oishi等[18]發現，ARs可以提高肝臟中的p-Akt表達，這可能與ARs維持血糖平衡相關。ARs還被證實可以激活PI3K/Akt，發揮細胞保護活性[14]。本研究表明，ARs能夠通過特異性激活PI3K/Akt發揮生物活性。

2.4 ARs主要單體對脂肪細胞胰島素抵抗改善作用的活性比較

不同字母表示不同樣本同一指標差異顯著(P<0.05)。圖5 ARs單體同系物對于炎癥誘導的脂肪細胞糖吸收水平改善作用分析Fig.5 Analysis of protective effect of ARs monomers on glucose uptake from adipocytes under inflammatory stress

進一步研究了小麥ARs的5種主要單體成分對于脂肪細胞胰島素抵抗改善作用，實驗結果見圖5。由圖5可知，在同等濃度下，與其余單體相比，十七烷基間苯二酚(AR-C17)能夠改善脂肪細胞胰島素抵抗，增加細胞對于葡萄糖吸收的效果最強，說明AR-C17為小麥ARs 主要活性物質，該結論與前人和本課題組先前研究結果一致。本研究團隊通過建立LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎癥模型，比較了5種單體抗炎效果，發現AR-C17具有最佳抗炎能力[15]，其原因可能是，相比于其余同系物，AR-C17的烷基鏈長度最短，使得其具有更高的溶解性[35]；同樣，Fan等[36]也發現，AR-C17是小麥ARs神經保護作用中的主要活性物質。

3 結 論

本研究發現，濃度為5、10、20 μmol/L的小麥ARs可以有效改善炎癥導致的脂肪細胞胰島素抵抗，2-NBDG吸收率隨ARs濃度增加而提高，證明小麥ARs具有一定的肥胖相關胰島素抵抗改善作用，且AR-C17能夠比其余4種同系物單體更有效地改善胰島素抵抗性。脂肪細胞脂解分析結果表明，ARs能夠顯著改善炎癥導致的脂肪細胞脂質分解；蛋白表達量結果表明，小麥ARs提高了p-Akt和GLUT4的蛋白表達水平，但是LY294002干擾ARs對脂肪細胞胰島素抵抗性的改善作用。本研究表明，小麥ARs通過激活p-Akt/GLUT4信號通路，可以改善炎癥導致的脂肪細胞脂質積累紊亂和胰島素抵抗。希望本研究結果能夠為全谷物食品健康功效的進一步研究提供理論參考。