半日花屬片段化居群的遺傳現狀及保護啟示

蘇志豪，卓 立，姜小龍，公延明

(1.中國科學院新疆生態與地理研究所干旱區生物地理與生物資源重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011; 2.新疆師范大學圖書館，新疆 烏魯木齊 830011; 3.中南林業科技大學林木遺傳育種實驗室，湖南 長沙 410004)

半日花屬(Helianthemum)為半日花科旱生小灌木，是古地中海植物區系孑遺種，其主要分布于新疆伊犁河谷的伊寧、鞏留、特克斯、博樂等地，在內蒙古主要分布于鄂爾多斯西部的桌子山山麓地區。半日花屬呈島狀殘遺分布，主要生長于海拔1 000～1 400 m的荒漠石質殘丘坡地上，株高10～15 cm，叢幅大約20 cm，結構緊密，呈灰綠色團狀，具有較高的園藝觀賞價值，在西北地區常用作庭園栽培觀賞植物，并且能適應極度干旱生境，也是用于干旱草原和礫質荒漠防風固沙的優良物種[4]。據早期植物志記載，分布于內蒙古的半日花和新疆的半日花被視為同一種(HelianthemumsongaricumSchrenk)[1]。趙一之等根據染色體數目以花的外部形態、花粉形態的差異將分布于內蒙古的半日花居群獨立成為一個新種——鄂爾多斯半日花(HelianthemumordosicumY.Z.Zhao, Z.Y.Zhu, et R.Cao)，并認為內蒙古的鄂爾多斯半日花是由準噶爾半日花(H.songaricum)進化衍化而來[2]。本文前期用葉綠體測序，驗證了新疆伊犁地區與內蒙古地區的半日花居群存在顯著的遺傳分歧，研究結果支持趙一之先生等人將內蒙古半日花(H.ordosicum)獨立成新種鄂爾多斯半日花的觀點[3]。

半日花屬目前分布面積十分狹小，由于開礦、樵采、放牧等人類活動過度干擾，導致其生境極度破碎化，居群數量急劇減少，生長發育和繁殖受到限制，實生苗日趨減少，天然更新日趨惡化[5]。半日花屬已被列入中國生物多樣性保護行動計劃植物種優先保護名錄，為國家二級保護植物[6]。如果不采取積極有效的保護措施，很有可能造成這一優良防風固沙物種遺傳多樣性及遺傳種質的迅速丟失，致使其難以適應未來氣候環境變化，使種群從目前的漸危逐步走向滅絕。瀕危植物有效的保護措施以準確的系統學分類以及掌握遺傳學基本信息為前提。由于前期使用葉綠體基因片段數量少，獲得的變異位點數量有限，對于半日花屬下物種的遺傳特征并未準確掌握，且半日花屬系統分類缺乏核DNA數據，因此，半日花屬的分類及遺傳特征的研究需要結合更多的葉綠體信息位點、核基因位點來進一步進行闡述。葉綠體微衛星(cpSSRs)技術實驗結果多態性高，穩定可靠，重復性好，廣泛應用于居群遺傳學研究中[7-9]，結合雙親遺傳的核DNA標記，將會為物種進化歷程的研究提供更多遺傳學信息[10]。本文用葉綠體微衛星及ITS序列研究半日花屬遺傳結構，探討分布于內蒙古西鄂爾多斯的半日花居群是否代表新的分類單元H.ordosicum以及半日花屬下兩個種的遺傳結構現狀，以期為半日花屬遺傳保護提供啟示。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究根據標本館標本信息記載(Chines Virtual Herbarium)、科研報告、科研論文，2010—2014年搜集了半日花屬在新疆伊犁河谷、準噶爾盆地及內蒙古西鄂爾多斯的分布信息，共采集到半日花屬15個居群，其中伊犁河谷8個(1～8)，準噶爾盆地博樂1個(9)，內蒙古西鄂爾多斯6個(表1，圖1)。

表1 半日花屬居群采集地位置及遺傳變異分布

圖1 半日花屬居群采集地位置分布

野外采集點的經緯度、海拔高度用GPS定位儀記錄。每個植株個體采集新鮮葉片，用硅膠保存，存4 ℃冰箱保存備用。

1.2 研究方法

本實驗葉片DNA的提取采用改進的2 × CTAB法[11]。提取到的總DNA純度與濃度用紫外分光光度計檢測。葉綠體微衛星引物參考Soubani等發表的半日花屬3個葉綠體微衛星多態性引物mtrnSf-trnGr，mtrnL2-trnF和mtrnL5-trnL3[12]，ITS2序列參考Sun等研究所用引物[13]。本實驗PCR體系為25 μL，其中包括25 ng DNA模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，0.5 unit Taq酶，5 μmol/L雙向引物。葉綠體微衛星PCR反應程序如下：95 ℃ 4 min；30個循環(92 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃延伸10 min；ITS2序列PCR反應程序如下：94 ℃ 5 min；35個循環(94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃延伸8 min。PCR反應在PTC-100 DNA上進行。葉綠體微衛星PCR產物在測序儀ABI 3730XL上分離，片段大小在軟件Geneious 7.0[14]上分析；ITS2序列用SEQUENCHER 4.8(Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA)編輯，用CLUSTALW軟件排列[15]，手工校正。

1.3 數據分析

對于每個葉綠體衛星引物所得到片段，按大小排列并組合得到最終單倍型變異。成對居群間遺傳距離(FST)用軟件GenAlEx 6.5計算[16]。根據此遺傳距離，進行分子方差分析，計算遺傳變異在居群內以及居群間的分配比例，采用10 000次置換進行顯著性檢驗[16]。利用居群成對遺傳距離，在軟件MEGA 6中用UPGMA法構建居群間親緣關系樹狀圖[17]。

2 結果與分析

2.1 等位基因和ITS序列分析

3個葉綠體微衛星標記共檢出13個多態信息位點，其中mtrnSf-trnGr 3個信息位點(133,134,135)，mtrnL2-trnF 4個信息位點(219,222,223,224)，mtrnL5-trnL3 6個信息位點(238,239,240,242,243,244)。將信息位點組合起來，154個個體共得到9個單倍型(H1～H9)。ITS2序列排列后長度為449 bp,在173 bp處發現一個替代信息位點(G/T)，在15個居群116個個體中，共有兩個核基因型(A和B)被檢測出。

2.2 遺傳變異地理分布

半日花屬9個單倍型中，H1～H4只分布于新疆地區，H5～H9只分布于內蒙古地區。在新疆地區9個居群中，單倍型H1廣布于其中的6個居群，分別是居群JMC，HST，KKS，ZYC，KB，KLBL；單倍型H2只分布于居群JMC中；單倍型H3分布于伊犁河谷的居群LK以及河谷北部的居群BL；單倍型H4只分布于伊犁河谷的居群BSD。在內蒙古西鄂爾多斯6個居群中，單倍型H5、H6廣布于所有的居群，單倍型H7、H8只分布于居群KBQ，單倍型H9 只分布于居群QPJ。核基因型A只分布于新疆地區，核基因型B只分布于內蒙古西鄂爾多斯高原(圖2)。

圖2 半日花屬葉綠體單倍型及核基因型地理分布

2.3 遺傳結構

在UPGMA樹中，半日花屬居群分為兩個大分支，新疆的居群聚為一支，內蒙古的居群聚為一支。新疆的9個居群被分為兩大分支：分支1包括居群HST，KKS，ZYC，KB，KLBL，JMC；分支2由兩個內在分支構成，一個包括居群BL和LK，另一個包括居群BSD。內蒙古的居群也被分為兩大分支，一支為KBQ，另一支為QPJ，HN，QLS，MX，QLG(圖3)。

圖3 UPGMA法構建的半日花屬居群親緣關系

分子方差分析表明，半日花屬79%(p<0.001)的遺傳變異發生于群體間，只有21%的遺傳變異發生于居群內部；將所有居群按地理區域劃分，67%的遺傳變異發生于地區間；在新疆地區，93%的遺傳變異發生于居群間；在內蒙古地區，22%的遺傳變異發生于居群間(圖4)。

圖4 半日花屬分子方差分析

3 討論

3.1 新疆地區與內蒙古地區半日花居群的遺傳分歧

核基因型與葉綠體單倍型數據均表明，新疆地區的半日花居群與內蒙古地區的半日花居群發生了明顯的遺傳分歧。半日花屬內兩個區分明顯的血統分支澄清了長期以來半日花屬下分類模糊的問題，支持趙一之先生等人的將內蒙古半日花居群獨立成新種鄂爾多斯半日花的觀點。在早第三紀，我國西北荒漠地區地形、氣候與現今相比，區別很大。古地中海植物區系的一些物種，如半日花，可能沿著古地中海遺跡，經河西走廊，擴散到阿拉善荒漠[18-19]。在晚第三紀，伴隨青藏高原的隆起，西北地區氣候變得干旱[20-21]。進入第四紀，北半球冰川開始發育，寒冷氣候在0.6～0.8 Ma到達極點[22]。在氣候劇烈變化過程中，西北地區很多植物物種正在逐漸滅絕消失[25]。氣候的劇變可能使得分布于河西走廊的半日花居群滅絕，導致半日花居群在新疆、內蒙古地區呈間斷分布。半日花單倍型網狀圖可以支持這一假設，圖中新疆、內蒙古兩地區單倍型由若干個缺失單倍型相聯結。半日花居群在河西走廊地區的缺失造成兩地區的基因流中斷。此外，兩地區雖同屬西部干旱區，但氣候差異明顯。伊犁河谷同中亞相聯結，氣候與中亞相似，夏季炎熱干旱，冬季溫和濕潤，而內蒙古西鄂爾多斯屬典型荒漠干旱氣候[23]。兩地區不同氣候可能孕育不同的遺傳變異，可能是其顯著遺傳差異的另一重要因素。

3.2 半日花屬遺傳結構

葉綠體微衛星數據表明準噶爾半日花居群間發生了顯著的遺傳分歧，鄂爾多斯半日花居群間也發生了一定程度的遺傳分歧。分子方差、居群親緣關系UPGMA樹也支持兩物種種下居群間的遺傳分歧。居群親緣關系UPGMA樹均表明，準噶爾半日花居群BL，LK和BSD顯著地區別于該地區其他居群；鄂爾多斯半日花居群KBQ顯著地區別于該地區其他居群。新疆、內蒙地區半日花屬下物種顯著的遺傳分歧與多重因素相關。(1)半日花產種率低。在胚和胚乳的發育過程中存在多種異常現象。例如，有些發育正常胚乳找不到胚；有些胚在多細胞原胚階段后停止分化；大多數胚珠沒有授精；正常發育胚珠少，使得產種率極低從而傳播能力十分有限[24]。此外，在干旱的氣候條件下，半日花種子萌發率很低[24-25]。(2)半日花居群生境呈破碎化。伊犁河谷被不同走向的山脈分為大小不等河谷[26]，準噶爾半日花居群分布于不同的河谷之中；同樣，鄂爾多斯半日花居群也分布于桌子山不同的山谷中。山谷間的地理障礙，加上有限的種子傳播能力，限制了半日花居群間的基因流，增加了居群之間的遺傳分歧。(3)準噶爾半日花與鄂爾多斯半日花居群都為小居群，小居群也能影響居群的遺傳結構。小居群易于發生遺傳漂變，近交幾率增加。近交會顯著降低居群的雜合度[27]，遺傳漂變使得等位基因流失[28]，居群的等位基因構成發生變化，使得居群間出現明顯的遺傳分歧。

3.3 半日花屬遺傳保護的啟示

生境片段化是眾多陸地生態系統植物面臨的嚴峻生存考驗[29]。生境片段化降低了植物遺傳多樣性水平及其對自然選擇的適應能力，有導致植物滅絕的風險[29]。本研究發現，片段化生境已導致半日花居群遺傳多樣性降低，應及時對其進行保護，據此提出以下保護策略：(1)由于半日花殘遺居群及個體都非常少，對其所有分布區、所有居群、個體都應加以保護；(2)加大宣傳力度，防止人為活動如過度放牧、樵采對天然居群的危害，建立相關自然保護區保護其自然生境；(3)對天然居群進行人工復壯，對于小居群，可以搜集原居群種子，育苗后移植到原居群以擴大其規模，對于適應生長但已滅絕的生境，還應在附近居群搜集種子，培育種苗，重建恢復間斷居群間的基因流；(4)構建核心種質資源，使其種質具有最大遺傳代表性，并選擇合適地點，建立種質資源圃，對其居群進行遷地保護。