基于網絡藥理學分析淫羊藿-三七配伍治療前列腺癌的潛在靶點及相關機制

劉德果，李姿蓉，趙 姣，陳其華*，蘇藝峰

(1.湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410000；2.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410008)

前列腺癌是男性發病率最高的惡性腫瘤，但現階段并無確切有效的治療手段[1]。諸多研究表明，中醫藥在改善前列腺癌患者具體癥狀、調控其精神心理狀態等方面具有明顯的療效[2]。

中醫古籍并無本病的記載，但根據其臨床表現及病機可歸于“癥瘕”“癃閉”“尿血”等疾病[3]。中醫學認為，前列腺癌病在男性之精竅，與腎、脾、肝等臟密切相關，脾腎虛衰，陰陽失調為發病之因，情志飲食傷及臟腑為起病之源，瘀毒久積、邪郁下焦為致病之標，在治療上多以扶正祛邪為治療原則，而“淫羊藿-三七”配伍是臨床上較常使用的溫陽活血抗癌藥對。現階段對淫羊藿、三七單味藥的藥效或藥理學相關研究較多，但對于“淫羊藿-三七”配伍應用于治療前列腺癌的藥效機制的報道較少，具體作用機制尚未明確。本文基于網絡藥理學研究方法，進行“藥物-成分-靶點-疾病”網絡可視化分析，在系統層面及分子水平對“淫羊藿-三七”配伍的藥物活性成分、潛在治療關鍵靶點以及相關機制進行研究，以期對“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的科學內涵進行探討，同時為接下來的基礎研究驗證“淫羊藿-三七”配伍作用機制提供證據。

1 材料與方法

1.1 篩選淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點

本研究借助TCMSP及TCMID等數據庫檢索淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點基因，篩選標準為：OB>30%，DL>0.18，HL>4 h。之后選擇TCMSP數據庫的“Related Targets”模塊，得到淫羊藿和三七的所有藥物靶點基因。

1.2 獲取前列腺癌疾病靶點基因

以“Prostate cancer”為關鍵詞，在GeneCards數據庫(https：//www.genecards.org)以及OMIM數據庫(https：//omim.org/)中進行檢索。在完成關鍵詞檢索后將上述兩個數據庫獲得的前列腺癌相關基因進行合并剔除重復項后建立“前列腺癌疾病靶點基因數據庫”備用。將淫羊藿、三七的藥物靶點基因與前列腺癌疾病靶點基因進行映射，獲得“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的靶點基因。

1.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡可視化分析

將淫羊藿、三七治療前列腺癌的靶點基因和步驟1.2篩選獲得的淫羊藿、三七活性成分進行映射，對藥物活性成分和靶點基因的關聯進行構建，獲得“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的藥物活性成分和關鍵靶點基因。Cytoscape軟件多用于構建生物分子相互作用的網絡可視化分析。結合前述步驟獲得的數據建立“Ingredient_Drug”“Ingredient_Target”“Disease_Target”“Drug_Disease”文件，將其導入Cytoscape3.7.1中進行網絡可視化分析。

1.4 蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡分析

借助STRING數據庫(https：//string-db.org)及CentiScape插件對蛋白質-蛋白質間的關系進行分析，以期構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網絡，展示其中的關鍵靶基因。

1.5 關鍵靶基因本體富集(GO)及京都基因與基因組百科全書通路富集(KEGG)分析

借助R軟件(Version3.5.2)安裝Bioconductor軟件包“colorspace”、“stringi”、“clusterProfiler”并運行，將淫羊藿與三七治療前列腺癌的關鍵靶基因轉換為entrez ID。之后將已完成轉換的entrez ID，對PPI網絡中的蛋白進行GO富集分析及KEGG富集分析，同時將分析結果以條形圖及氣泡圖形式導出。

2 結果

2.1 淫羊藿及三七的藥物有效活性成分與藥物靶點

在TCMSP數據庫檢索關鍵詞“淫羊藿”“三七”分別獲得130個和119個活性成分。以OB>30%，DL>0.18，HL>4 h為條件進行篩選，分別篩選出18個淫羊藿及7個三七活性成分，去重后共獲得24個“淫羊藿-三七”配伍的有效活性成分。選取“Related Targets”模塊，獲得1 620個淫羊藿、716個三七所有活性成分對應的靶點基因。“淫羊藿”“三七”配伍的主要有效活性成分見表1。

表1 “淫羊藿-三七”配伍的主要有效活性成分

2.2 前列腺癌疾病靶點基因獲取

在GeneCards及OMIM數據庫檢索關鍵詞“Prostate cancer”，共篩選出11 667個前列腺癌疾病靶點基因。將淫羊藿、三七的藥物靶點基因與前列腺癌疾病靶點基因進行映射，共獲得64個“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的靶點基因，見圖1。

注：“淫羊藿-三七”配伍活性成分對應的靶點基因與前列腺癌相關基因有64個共同靶基因。

2.3 “藥物-成分-靶點-疾病”網絡構建

將“淫羊藿-三七”與對應活性成分(Ingredient_Drug)、活性成分與關鍵靶基因(Ingredient_Target)、關鍵靶基因與前列腺癌對應關系(Disease_Target)、“淫羊藿-三七”與疾病靶點基因(Drug_Disease)以及屬性導入到Cytoscape，構建“藥物-成分-靶點-疾病”網絡，見圖2。使用CentiScape插件計算藥物活性成分DC，節點的DC越大，提示該節點在網絡中權重越大。Quercetin(槲皮素)為69，luteolin(木犀草素)為32，keampferol(山奈酚)為19，Anhydroicaritin(脫水淫羊藿素)為14、8-Isopentenyl-kaempferol為12，位于前五位。由圖2可知，網絡圖中有多個節點及邊，提示藥物靶點基因與疾病靶點基因之間存在較多的交集作用，充分體現“淫羊藿-三七”配伍是通過多成分、多靶點、多通路協同作用的方式發揮治療前列腺癌的作用。其活性成分DC較高的藥物如槲皮素、木犀草素、山奈酚、脫水淫羊藿素等具有較顯著的抗氧化應激、抗細胞凋亡以及調節免疫功能作用，與相關文獻報道一致[17-18]。

注：菱形為前列腺癌，六邊形為“淫羊藿-三七”配伍，長方形為“淫羊藿-三七”配伍活性成分，橢圓形為關鍵靶基因，連線代表各節點間相互關系。

2.4 PPI網絡構建

把獲得的關鍵靶基因導入于STRING的Multiple proteins模塊，置信度為0.4，將PPI.tsv文件導入到Cytoscape軟件，獲得64個PPI網絡基因。以CentiScape插件計算出DC均值為13.7，選取DC大于均值的基因作為核心基因以大于17.8進行篩選，獲得26個核心基因，具體見圖3。

圖3 藥物-疾病靶點蛋白相互作用網絡

2.5 GO功能富集分析

通過GO功能富集分析筆者共富集到82個生物學過程及功能，經校正排序后對位于前20的生物過程進行條形圖展示，具體見圖4。“淫羊藿-三七”配伍主要參與的生物過程包括泛素樣蛋白連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合、核受體功能、直接配體調節序列特異性DNA結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、類固醇激素受體活性、類固醇結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、細胞凋亡、雌激素受體結合、激活轉錄因子結合、類固醇激素受體結合、核激素受體結合、單加氧酶活性、氧化還原過程、激素受體結合、激酶調節活性、轉錄輔因子結合、組蛋白激酶活性等。

圖4 關鍵靶點基因GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析

通過KEGG通路富集分析筆者共富集到56條細胞信號通路，經校正排序后對位于前20的細胞信號通路進行氣泡圖展示，具體見圖5。“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的主要細胞信號通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞衰老、p53等細胞信號通路。

圖5 關鍵靶點基因KEGG通路富集分析

3 討論

現階段，隨著對前列腺癌發病及治療相關機制的研究不斷取得進展，其龐雜的病理機制逐漸被揭示，現代醫學認為，前列腺癌的形成機制包括腫瘤雄激素受體機制、干細胞形成機制以及炎性刺激相關機制等[4]。諸多臨床研究結果顯示，“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌可獲得良好的臨床效果。然而，在中藥中存在多成分、多靶點的特征，各藥物活性成分間相互交集及作用形成了龐雜的相互作用網絡，所以給研究者探究其治療有效成分及相關機制造成了較大的困難。

在本研究中，淫羊藿及三七的藥物主要活性成分包括槲皮素、木犀草素、山奈酚、脫水淫羊藿素、8-Isopentenyl-kaempferol等。Mzhelskaya等[5]的研究結果顯示，槲皮素能夠通過調控細胞周期、腫瘤血管生成因子(VEGF)以及制止耐藥基因表達降低前列腺癌細胞的增殖、遷移并誘導其凋亡，其常見的細胞信號通路多為磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細胞凋亡等。木犀草素具有顯著的抑制前列腺癌細胞增殖功能，李楠等[6]的研究表明，木犀草素能夠顯著抑制與細胞增殖緊密關聯的JAK2/STAT3細胞信號通路以及Ki67的蛋白表達，并在一定程度上呈劑量依賴性。El-Kott等[7]發現，山奈酚能夠誘導前列腺癌細胞的細胞周期阻滯于S期，并且可促進前列腺癌細胞凋亡；Sinha等[8]研究表明，山奈酚可抑制雌激素受體alpha(ESR1)使LNcap細胞的侵襲性下降，同時能夠抑制上皮間質轉化(EMT)。脫水淫羊藿素具有較強大的雌激素活性及抗氧化活性，同時具有促進細胞凋亡功能[9]。8-Isopentenyl-kaempferol目前相關研究較少，有研究顯示其與細胞氧化應激機制相關[26]。故“淫羊藿-三七”配伍里的活性成分與前列腺癌的發生、發展及治療密切相關，對于前列腺癌的治療有著重要作用。

對構建的“藥物-成分-靶點-疾病”網絡以及PPI網絡進行分析，顯示ESR1、AR、CCND1、VEGFA、CASP3、MYC、HIF-1A等核心靶點與眾多藥物有效成分存在交互作用，并在構建的網絡中表現出聚集現象，提示上述核心靶點可作為“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在靶點，值得進一步的實驗研究證實。其中雌激素受體(ESR1)是一類固醇類激素蛋白，能夠與雌激素特異性結合使其發揮激素生物學效應，干預相關細胞信號通路調控前列腺上皮細胞以及前列腺癌細胞的生長、增殖以及凋亡等生物學過程。關鍵靶點基因GO功能富集分析結果顯示，“淫羊藿-三七”配伍參與的生物過程主要集中于泛素樣蛋白連接酶結合、泛素蛋白連接酶結合，核受體功能、轉錄因子活性、直接配體調節序列特異性DNA結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子結合等轉錄調控相關功能，以及細胞凋亡、氧化應激等方面[10-13]。上述生物學過程以及功能體現在于“淫羊藿-三七”的有效活性成分調控相應的靶點基因以及細胞信號通路的過程中。KEGG通路富集分析結果表明，上述“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在靶點與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞衰老、p53等細胞信號通路的調控息息相關，提示上述生物學過程及功能和前列腺癌的發生、發展以及侵襲轉移密切相關。上述生物學過程及相關機制表明，前列腺癌的疾病靶點主要集中在細胞凋亡、細胞周期、細胞增殖、分化、遷移以及血管生成等方面。基于此，本研究揭示了“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的多成分、多靶點、多通路協同作用機制可能與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)、細胞凋亡、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、內分泌抵抗、腫瘤壞死因子(TNF)、細胞衰老、p53等相關，為“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的進一步研究提供一定的借鑒及參考。

本研究分析了藥對“淫羊藿-三七”配伍作用的關鍵潛在靶點以及相關細胞內信號轉導通路，提示其能夠通過促進細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、降低內分泌抵抗、殺傷腫瘤細胞以及抑制腫瘤血管生成等途徑發揮抗腫瘤作用。初步揭示了“淫羊藿-三七”配伍治療前列腺癌的潛在調控機制，體現了中藥多成分、多靶點、多通路協同作用的特點，為“淫羊藿-三七”配伍藥理研究及臨床應用提供了理論依據。