補腎活血法改善精子DNA完整性損傷臨床研究

李俊君，董 良，譚 琨，余 顏，俞旭君，陽 方

(成都中醫藥大學附屬生殖婦幼醫院，四川 成都 610041)

男性不育癥為男科常見的疾病之一，近年來發病率不斷上升，已成為一個全球化的社會性問題[1]。男性不育癥可能是多種因素造成的結果，在影響人類精子發生的因素中，精液常規檢查異常引發的不育已被大眾熟知，但仍有檢查正常的男性也存在不育。經研究發現，精子DNA損傷作為一種新的精子功能評價指標越來越受到關注[2]。

精子DNA損傷可影響精子的受精能力、受精卵的分裂以及胚胎發育，是影響生育的重要因素。DNA碎片率(DNA fragmentation index，DFI)是目前較常用于評估精子DNA完整性損傷程度的指標，當精子DNA損傷比例大于30%以上時，男性的自然生育力顯著降低[3]。氧化應激是精子DNA損傷發生的一個機制。氧化應激指機體遭受各種有害刺激時，體內高活性分子如ROS和活性氮自由基(RNS)產生過多，氧化程度超出抗氧化物的清除范圍，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。過氧化物歧化酶(SOD)是能特異性地清除ROS的一種酶，因此，SOD測定能體現精子在男性生殖道運行中氧化抗氧化的水平和能力。

中醫學關于男性不育癥的論述主要集中在“無嗣”“無子”等方面。對于久病之人，腎氣嚴重虧損，無處藏精，故久病必虛，虛則血瘀，當用補腎活血之法。成都中醫藥大學附屬醫院研發的 “強精片”具有補腎強精、活血化瘀、清熱利濕的功效，臨床應用已達15年余。研究發現[4]，該藥可顯著改善男性不育癥患者精子動態及形態，有增加精子密度、增加精子活率及活力、改善精子形態等作用。

本文將從“強精片”入手，研究補腎活血法抗氧化作用對腎虛血瘀型男性不育癥患者精子DNA損傷的影響并探索其作用機制。

1 資料與方法

1.1 診斷標準

1.1.1 西醫診斷標準 參照《人類精子學》(2013版)、《歐洲泌尿外科學會疾病診斷治療指南》(2014版)、《人類精液檢查與處理實驗室手冊》(WHO第五版，2009年)以及相關試劑盒說明書等制定。(1)夫婦同居一年以上，性生活正常，未采取避孕措施，女方生殖機能正常，因男方因素造成女方不孕者。(2)實驗室檢查：①精子DNA碎片率(DFI)異常(正常精子DNA損傷率為0%～15%；輕度損傷：精子DNA損傷率為15%～30%；重度損傷：精子DNA損傷率為>30%)。 ②精子活性氧自由基(ROS)異常(正常測試范圍：0 RLU/s-5.5RLU/s×104)。③超氧化物歧化酶(SOD)異常(正常測試范圍：0.5～15 0ng/mL)。

1.1.2 中醫辨證診斷標準 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》(2002版)、《中國中西醫結合男科學》(張敏健、郭軍主編，2011版)制定。主證：久婚未育，腎虛血瘀：腰膝酸軟，神疲乏力，小腹隱痛(痛有定處)；次證：性欲低下，頭暈耳鳴，小便清長，皮下包塊(瘀斑)，舌質紫暗有瘀斑，脈澀或沉細。凡具備主證1項或2項、次證2項，結合舌脈改變，經兩名及以上副高專業技術職稱人員參與診斷，方可成立。

1.2 納入標準

①符合西醫診斷標準，并且符合中醫辨證診斷標準；②不育年限達1年以上，年齡20～55歲的男性不育癥患者；③DFI>15%；④無嚴重器質性疾病和精神、神經系統疾病；⑤患者自愿受試并簽署知情同意書。

1.3 排除標準

①因女方因素導致的不能生育者；②泌尿生殖感染、激素異常、染色體核型異常及免疫性引起的男性不育；③合并有心血管、肝、腎和造血系統等嚴重原發性疾病及精神病患者；④不能按規定服藥，無法判斷療效或資料不全等影響療效和安全性判斷者；⑤取精困難不能滿足實驗室檢查者。

1.4 一般資料

研究對象為2015年1月-2015年12月就診于成都中醫藥大學附屬醫院的72例男性不育癥患者，中醫辨證為腎虛血瘀型，以1∶1隨機分為兩組。研究對象中年齡最小者22歲，最大者43歲，平均年齡(31.71±4.55)歲。

1.5 治療方法

對照組：五子衍宗丸治療(提供單位：成都中醫藥大學附屬醫院，每盒10袋，每袋6g)，每次1袋，飯后溫水吞服，1日2次。連續治療3個月。

治療組：強精片治療，組方：人參、當歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、鹿角膠、車前子、益母草、桃仁、丹參(提供單位：成都中醫藥大學附屬醫院中藥制劑中心，規格100片/瓶，每片0.3 g，每片含生藥0.35 g)，每次4片，飯后溫水吞服，每日3次，連續治療3個月。

1.6 觀察指標

通過檢測受試者服藥前后精子DNA碎片率(DFI)、精子活性氧自由基(ROS)、超氧化物歧化酶(SOD)的變化來評價療效。DFI檢測采用深圳市博瑞德生物科技有限公司生產的精子DNA碎片檢測試劑盒(商品名：SpermFuncRDNAf，產品標準號：YZB/粵0439-2010)進行檢測。主要方法是利用精子染色質擴散法。ROS檢測使用南京建成生物工程研究所研發的試劑盒(產品序號：E004，規格：100T-500T，產品許可證：蘇ICP備12006455號)，用化學發光法檢測精液ROS水平。SOD變化采用ELISA生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(商品名：Human SOD ELISA kit，貨號：XL-Eh1377，規格：96孔/盒，Abcam公司生產，北京永輝生物科技有限公司進口)進行檢測。

1.8 統計學方法

2 結果

本研究納入72例患者，每組各36例，試驗過程中治療組患者因工作原因脫落2例，對照組脫落3例，1例因療效不滿意終止，2例因準備試管嬰兒治療而終止。

2.1 治療組與對照組平均年齡及不育年限分析結果

通過對兩組男性年齡進行分析，t=1.16，P=0.288 3，P>0.05，因此兩組年齡無統計學意義，兩組具有可比性。對兩組男性不育年限的數據分析，平均不育年限為(4.50±1.58)年，經分析得出兩組不育年限均呈非正態性分布，故采用Z檢驗，Z=1.27，P=0.2679，P>0.05，提示兩組平均不育年限無統計學意義，兩組具有可比性。

表1 兩組患者平均年齡、不育年限比較

2.2 治療前受試者年齡與DFI、ROS、SOD相關性分析

對72例受試者年齡與DFI、ROS、SOD進行相關性線性分析，圖1所示年齡與DFI，其線性擬合比率F=4.50，P<0.000 1，具有統計學意義，表明受試者年齡與DFI呈正相關；圖2所示DFI與ROS，其線性擬合比率F=0.47，P<0.000 1，具有統計學意義，表明受試者ROS與DFI有相關性，二者呈正相關；圖3所示ROS與SOD，其線性擬合比率F=-7.86，P<0.000 1，具有統計學意義，表明ROS與SOD有相關性，二者呈負相關。

圖1 年齡與DFI相關性分析

圖2 DFI與ROS相關性分析

圖3 ROS與SOD相關性分析

2.3 試驗后治療組與對照組DFI、ROS、SOD比較分析

治療組治療前DFI平均值為(25.24±9.76)，經過3個月治療后，治療組DFI平均值為(10.95±4.55)，Z=9.272 8，P=0.004 5，P<0.05，差異具有統計學意義。對照組治療前DFI平均值為(23.37±9.91)，經過治療后，對照組DFI平均值為(15.38±6.33)，Z=8.36，P<0.000 1，差異具有統計學意義。由表2可知，試驗組與對照組比較DFI顯著下降。

表2 試驗組、對照組治療前后DFI值比較

表3 兩組患者治療前后ROS(RLU/s)比較

治療組治療前ROS平均值=(41.41±19.28)%，經過3個月的治療后，治療組ROS平均值為(13.74±8.88)%，Z=4.20，P=0.000 2，P<0.05，差異具有統計學意義。對照組治療前ROS平均值=(42.91±19.74)%，經過治療后，對照組DFI平均值為(20.37±12.65)%，Z=3.21，P=0.018 1，P<0.05，具有統計學意義。治療組、對照組ROS平均值較治療前有顯著下降，且治療組下降明顯。

表4 治療組、對照組治療前后SOD比較

治療組治療前SOD平均值為(14.19±7.15) ng/mL，經過3個月的治療后，治療組SOD平均值為(28.01±11.18) ng/mL，Z=7.19，P=0.011 2，P<0.05，差異具有統計學意義。對照組治療前SOD平均值為(15.99±6.40) ng/mL，治療后，對照組SOD平均值為(20.20±6.25) ng/mL，Z=6.98，P<0.000 1，差異具有統計學意義。表明治療組SOD平均值較治療前有顯著提高，且優于對照組。

2.4 中醫證候評分療效比較

兩組患者經過3個月治療后，治療組總有效率為77.78%；對照組總有效率為66.67%，P<0.05，差異具有統計學意義。表明治療組運用補腎活血法(強精片)能有效改善中醫臨床癥狀，且優于對照組。

表5 兩組患者中醫證候評分療效比較 (n)

3 討論

中醫學認為，精子的生成依賴于腎氣的溫煦與滋養。腎為先天之本，是發育生殖之源。《黃帝內經》提出了以“腎”為軸心的生殖理論。《素問·上古天真論》云：“丈夫……二八，腎氣盛，天癸至，精氣溢瀉，陰陽和，故能有子”。腎氣的盛衰，天癸的有無，臟腑功能是否協調，直接決定著男性的生殖能力的強弱。故精子質量異常所致男性不育癥與中醫學的腎虛關系密切。瘀血作為病理產物，可因濕、熱、郁煎熬日久，或壅滯血脈，滯血成瘀，或肝失疏泄，氣滯阻絡而成。《臨證指南醫案》云“凡經主氣，絡主血，久病血瘀”，“初為氣結在經，久則血傷入絡”。皆因病久氣血陰陽虧虛，無力鼓動血運，血滯于經；或久病而致氣機逆亂，氣滯則瘀血易生。男性產精的主要器官睪丸屬“陰器”，屬體表絡脈系統，容易因久病而氣血瘀滯。《素問·調經論》云“血氣不和，百病乃生”，瘀血內停，脈絡瘀滯，氣血不運，睪丸失養受損，腎虛精虧，發為不育。在臨床中，腎虛與血瘀往往并見，但亦有腎虛為因、血瘀為果者。腎虛可分為精虧、腎氣虛、腎陽虛、腎陰虛，然而無論何種腎虛，都有致瘀的可能。《內經》有“肝腎同源”之說，精之不足，無以化血，瘀血而成。故腎虛與血瘀的關系尤為密切，不能分而立論。

現代醫學認為，中醫理論的腎大致可以理解為現代醫學的下丘腦-垂體-性腺、腎上腺組成的內分泌調節軸。精子的發生、成熟、運行以及維持正常和穩定，是通過此軸系的相互匹配、調節整合作用來實現的[5]。更有學者對中醫的腎之本質進行研究，認為下丘腦-垂體-性腺軸功能失調是男性不育癥的常見病因[6-7]。血在男性生殖生理中起重要作用。首先血有濡養、滋潤生殖器官的作用；其次血能運輸天癸以達全身，腎氣足則天癸至，發揮正常的生理效應：第三，血在體內運行不息，流至精室時，在天癸作用下，可變化為精液。故唐容川在《血證論》中云：“血人丹田，亦從水化，而變為水，以其體內為血所化，故非清水，而極濃極稠，謂之腎精。”現代醫學也認為正常的血液運行是生殖系統有生育能力的基本條件。

本研究使用的“強精片”由人參、當歸、枸杞子、菟絲子、淫羊藿、鹿角膠、車前子、益母草、桃仁、丹參等藥物組成。方中枸杞、菟絲子補腎益精，共為君藥。鹿角膠、淫羊藿溫補肝腎，益精養血，二者鼓舞腎中陽氣，使陰得陽助，而泉源不竭；人參補氣生津，丹參、桃仁、當歸養血活血，氣旺血行，六者合而為臣，使氣血順，陰陽調。車前子清熱解毒、利尿；益母草活血化瘀，利水調經，二者共用，一泄腎中虛火，二可制約溫熱藥物之患，三則利水消腫，使水濕得行，邪有出路。桃仁、丹參行血破瘀，使氣血通暢。四者相合為佐藥。縱觀全方，具有“陰陽氣血并調、肝腎兼顧；補中有通、補中有清”的特點。故有補腎填精、活血化瘀、清利濕熱的功效，可提高男性生殖能力。

研究發現，強精片能提高精子密度、活力及活率、改善精子形態[8-9]。基礎研究證實[10]，強精片可改善和調節大鼠附睪功能性指標，增加附睪重量和管壁厚度，促進損傷附睪上皮恢復和上皮細胞的分泌，提高睪丸附睪器官系數，增加附睪液SA含量，降低精子膜GPC含量，從而改善附睪精子成熟功能，起到改善精子質量的作用。多項研究顯示[11-12]，強精片能通過下調Fas/FasL表達，降低睪丸內ABP表達量，影響Occludin蛋白，控制支持細胞對生精細胞的凋亡誘導，調節BTB。強精片可能通過增加精子尾部鞭毛結構蛋白TUBB、DMHC7、TCTE3的表達，提高精子活力[13]。同時強精片可增加精液中TGF-β1的表達量，降低睪丸中波形蛋白的表達量，上調Cdyl、G9a表達，下調HDAC1表達，降低睪丸組織細胞凋亡率，改善模型大鼠受損睪丸結構[14-15]。

五子衍宗丸共五味藥，包括五味子、枸杞子、菟絲子、覆盆子、車前子，方中枸杞子、菟絲子補腎精、壯陽道、助精神；覆盆子養真陰、固精關、起陽痿；五味子補腎水、益肺氣、止遺泄；車前子利小便，與上述四子相配，補中寓瀉，補而不膩。諸藥相配成方，共奏補腎益精之功。

現代醫學中補腎法、活血法在臨床治療男性不育癥中均有較好的療效。李海松等[16]分別采用溫陽補腎、滋陰補腎、益腎填精等方法治療男性不育癥均取得令人滿意的臨床療效。國醫大師何任教授[17]以活血化瘀法治療不育癥亦取得較好的療效。研究發現[18]，補腎填精、活血化瘀可改善睪丸、附睪功能及精子發生、成熟的微環境，促使缺陷精子修復為正常精子。中醫學許多補腎藥具有促性腺激素和性激素樣作用。同時，活血藥也可改善生殖器官局部的血液循環[7]。以補腎活血為治則的補腎活血育精方、益腎活血方、生精湯可明顯改善腎虛血瘀型男性不育癥的精子質量，有效提高精子濃度、精液量、存活率、PR和正常精子百分比，減少患者精液液化時間，降低PAS和DFI[19-21]。

精子DNA是遺傳信息的載體，若精子DNA受損，將會導致精子功能和受精能力下降，甚至發生不育。對于精子DNA損傷的確切機制，目前的研究主要包括3個方面：生精過程中的細胞凋亡、運輸過程中的氧自由基影響及包裝過程中的染色質異常。精子DNA的損傷形式主要包括精子DNA碎片、染色質包裝異常和魚精蛋白缺乏，其中最主要的損傷形式是精子DNA碎片，包括精子DNA單鏈或雙鏈的斷裂。高水平的ROS影響精子細胞核中DNA的完整性。不育男性精子DNA碎片明顯增多。當精子暴露于人為的ROS環境中，會造成精子DNA的氧化修飾、DNA鏈的斷裂、交聯、片段的氧化、產生游離的片段，造成缺失、DNA的染色質的重組。氧化應激與DNA鏈的斷裂有密切關系[22]。精子DNA的損傷是多種因素共同作用的結果，主要包括生殖道的感染、腫瘤，各種化學、物理因素，生活環境及習慣，年齡以及季節溫度等。臨床上常見的影響精子DNA損傷的生殖系統疾病多見于精索靜脈曲張、睪丸扭傷或創傷、隱睪、睪丸腫瘤、泌尿生殖系炎癥等。SOD是一種含Zn、Cu的酶，是抗氧化酶中重要的一種，也是體內主要的自由基清除劑，能抑制自由基引起組織損傷的主要環節——脂質過氧化反應。因此ROS和SOD對男性不育患者精子DNA損傷有較大的參考價值。

目前臨床已有多種方法可用來改善精子DNA損傷，其中比較常用的治療方法包括抗氧化劑治療、治療感染、睪丸取精、精索靜脈曲張手術等。抗氧化劑可以中和精液中過量的ROS，減少ROS含量，避免誘導氧化應激反應，以減少對精子DNA的損傷。研究表明，對精子DFI偏高的不育患者使用抗氧化劑治療后，精子DFI降低，明顯提高妊娠率[23]。同時現代實驗研究發現，補腎藥、活血藥中含有很多與生精有關的微量元素，同時對氧化應激損傷也有很大改善。這可能是補腎活血法改善精子DNA損傷的機制理論依據。本次研究也證實，治療組使用補腎補血法(強精片)治療前DFI平均值為(25.24±9.76)%，經過3個月的治療后，治療組DFI平均值為(10.95±4.55)%，其DFI測值顯著降低；治療組治療前SOD平均值為(14.19±7.15)ng/mL，治療后治療組SOD平均值為(28.01±11.18)ng/mL，SOD平均值較治療前有顯著提高。因補腎活血藥中大部分中藥成分中含有抗氧化物，可中和過多的ROS，提高SOD活性，減少氧化應激反應，故而減輕精子DNA損傷。

總的來講，補腎活血法(強精片)可清除體內過剩的活性氧自由基，提高人體內多種抗氧化酶(包括SOD)的活性，降低體內生物分子的氧化產物(包括脂類氧化產物MDA，以及DNA和蛋白質的氧化物)，減輕精子DNA鏈的斷裂、交聯、片段的氧化及缺失，抑制氧化應激反應，改善精子DNA損傷，從而提高男性不育癥患者的生育能力。