正交試驗優選蛇莓總酚酸提取工藝

趙鴻賓，劉曉夢，韓忠耀，李雪營，魏學軍，張林甦*，余躍生

(1.黔南民族醫學高等專科學校，貴州 都勻 558013；2.貴州醫科大學第三附屬醫院，貴州 都勻 558000)

蛇莓為薔薇科蛇莓屬植物蛇莓(Duchesneaindica(Andr) Focke )的全草，別名“三匹風”“地莓”“一點紅”“蛇含草”[1]，為民間常用草藥。蛇莓性寒，味甘、苦，有小毒，入肺、肝、大腸經，具有清熱解毒、消腫散瘀、收斂止血、涼血之功效，用于治療熱病驚癇、咽喉腫痛、咳嗽吐血、疔瘡癰腫、蛇蟲咬傷、濕疹、痢疾及燙火傷等[2-3]。近年來研究發現蛇莓不僅具有抑菌活性和抗氧化作用，而且具有較強的抗腫瘤和抗誘變活性，還能增強機體免疫功能[4-10]。在臨床上，蛇莓常與其他中藥配伍用來治療婦科炎癥和腫瘤[11]，包括乳腺癌、肺癌、肝癌、結腸癌和子宮肌瘤等。

現代藥理實驗研究表明，蛇莓水提取物抗腫瘤活性顯著，且水提物中酚酸類成分活性較強[12-16]。然而近年對于蛇莓總酚酸提取工藝未見報道，因此本研究以酚酸類成分的提取率為評價指標，利用正交試驗設計對蛇莓中酚酸類成分的提取工藝進行優化，以期促進民間常用草藥的研究與開發，同時也為蛇莓產業化生產提供參考。

1 實驗材料

1.1 藥材與試劑

蛇莓：采自黔南民族醫學高等專科學校沙木湖校區附近山坡和荒地，經魏學軍教授鑒定為薔薇科蛇莓屬植物Duchesneaindica(Andr) Focke的干燥全草。

試劑：沒食子酸標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110831-201605)；十二烷基磺酸鈉(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20180919)；鐵氰化鉀(成都金山化學試劑有限公司)；三氯化鐵(天津市大茂化學試劑廠)；甲醇、乙醇均為分析純，蒸餾水為實驗室自制雙重蒸餾水。

1.2 儀器設備

Agilent Cary 100型雙光束紫外可見分光光度計(北京安捷倫公司)，奧豪斯DV215CD型分析天平(奧豪斯儀器有限公司)，電熱恒溫干燥箱、電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備

精密稱取蛇莓藥材粉末1.0 g，置于錐形瓶中，精密加入一定體積的不同濃度的乙醇溶液，精密稱定其總質量，在一定溫度的水浴中加熱回流提取1～2.5 h。待提取液冷卻后稱重并補足減失的重量，過濾，即得。

2.2 對照品儲備液制備

精密稱定沒食子酸對照品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解至刻度，得到濃度為0.10 mg/mL的沒食子酸對照品儲備液。

2.3 總酚酸含量測定

2.3.1 沒食子酸標準曲線制作 精密量取0.10 mg/mL的沒食子酸儲備液1.0 mL置于10 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，分別精密量取0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL、1.00 mL、1.20 mL至25 mL容量瓶中，各加甲醇5.0 mL，0.3%的十二烷基磺酸鈉溶液2.0 mL，0.06%的鐵氰化鉀-0.9%的三氯化鐵溶液(1∶1)混合溶液1.0 mL，搖勻，暗處放置5 min。加0.1 mol/L的鹽酸溶液至刻度，搖勻，在暗處放置20 min。用紫外-可見分光光度計對某一濃度供試液進行全波長(400～900 nm)掃描。以波長為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖，得到吸收曲線，確定745 nm為最大吸收波長。然后在745 nm波長下測定剩余供試液的吸光度，以吸光度為縱坐標，沒食子酸濃度(μg/mL)橫坐標，得回歸方程：Y=0.552 2X+0.315 6，R2=0.998 6。數據表明沒食子酸濃度在0.04～0.48 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.2 精密度試驗 精密量取0.10 mg/mL沒食子酸對照品溶液6份，每份1.00 mL，分別按“2.3.1”項下方法進行顯色處理，在745 nm波長下測定其吸光度。計算相對標準偏差RSD為1.2%，說明儀器精密度良好。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取蛇莓干燥粉末6份，每份1.0 g，分別置于錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，80 ℃水浴回流提取2 h。待提取液冷卻后稱重，補足減失的重量，過濾。取續濾液按“2.3.1”項下方法進行顯色，測定其吸光度。RSD=1.6%，說明該測定方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗 精密稱取1.0 g蛇莓干燥粉末，按照“2.3.3”項下方法進行提取，取續濾液分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h時按“2.3.1”項下方法進行顯色，測定其吸光度。測定結果的相對標準偏差RSD為1.2%，結果表明蛇莓提取液在12 h內穩定，對測定結果無明顯影響。

2.4 總酚酸提取工藝優化

2.4.1 液固比 精密稱取蛇莓干燥粉末15份，每份1.0 g，分成5組，每組平行3份，各組分別按照液固比10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1加入70%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取2 h。待提取液冷卻后稱重，補足減失的重量，過濾。取續濾液按“2.3.1”項下方法進行顯色，測定其吸光度，計算總酚酸提取率。所得數據滿足方差齊性要求，均值依次為1.98%、2.67%、2.95%、3.12%、3.15%，單因素方差分析結果表明組間差異顯著。總酚酸提取率隨著液固比變化如圖1(a)所示：液固比在30∶1以上，總酚酸提取率較高。

2.4.2 乙醇濃度 按“2.4.1”項下實驗分組方法，各組均按照液固比20∶1分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液，于80 ℃水浴加熱回流提取2 h。按“2.4.1”項下方法進行后續處理，測定其吸光度，計算總酚酸提取率。總酚酸的提取率均值分別為2.45%、3.01%、2.85%、2.38%、1.87%，各測定結果均符合方差分析要求，且組間差異顯著。總酚酸提取率隨著乙醇濃度的變化如圖1(b)所示：乙醇濃度為60%時，總酚酸提取率較高。

2.4.3 提取溫度 按“2.4.1”項下分組方法，各組均按照液固比20∶1加入60%乙醇，分別于60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃水浴加熱回流提取2 h。按“2.4.1”項下方法進行后續處理，測定其吸光度，計算總酚酸提取率均值分別為2.76%、2.98%、3.16%、2.93%、2.71%，結果如圖1(c)所示：在80 ℃水浴條件下，總酚酸的提取率達到2.08%。數據經單因素方差分析，組間差異顯著。

2.4.4 提取時間 按“2.4.1”項下分組方法，各組均按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取，各組提取時間按照30 min、60 min、90 min、120 min、150 min進行，按“2.4.1”項下方法進行后續處理，測定其吸光度，計算總酚酸提取率均值分別2.11%、2.58%、2.93%、3.04%、2.65%，數據經單因素方差分析顯示，組間差異顯著。結果如圖1(d)所示：提取時間為120 min時總酚酸提取率最佳。

圖1 液固比、乙醇濃度、加熱溫度、提取時間對總酚酸提取率的影響

2.4.5 提取次數 按“2.4.1”項下實驗方法，精密稱取蛇莓干燥粉末3份，每份1.0 g，按照液固比20∶1加入60%乙醇，于80 ℃水浴加熱回流提取120 min，待提取液冷卻后稱重，補足減失的重量，過濾。將過濾后的濾渣同法提取第2、3次，分別按“2.4.1”項下方法進行后續處理，測定其吸光度，分別計算總酚酸提取率。第1、2、3次的提取率分別為2.1%、0.84%、0.51%，第2、3次提取率明顯降低，從節約資源和縮短生產周期的角度考慮，選擇提取1次為宜。

2.4.6 正交試驗設計 依據單因素方差分析可知，液固比、乙醇濃度、提取溫度、提取時間均對總酚酸提取率有顯著影響，且組間差異顯著，由此確定正交試驗的因素和水平。L9(34)正交試驗因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平

2.4.7 正交試驗結果及方差分析 按照L9(34)正交試驗表依次進行，每個實驗平行3次。試驗方案及結果見表2。由表3方差分析可知，固液比(A)對總酚酸提取率影響極其顯著(P<0.01)，乙醇濃度(B)對總酚酸提取率影響顯著(P<0.05)，而提取溫度(C)和提取時間(D)影響不顯著(P>0.05)，各因素影響程度依次為：A>B>C>D。優化工藝參數為A3B2C2D2。

表2 正交試驗結果

表3 方差分析結果

2.4.8 驗證試驗 在正交試驗設計優化的最佳條件下，對蛇莓總酚酸進行5次平行提取試驗，平均提取率為3.75%，RSD=1.41%。

3 討論

本實驗在單因素試驗的基礎上，通過設計4因素3水平9次正交試驗得到優選的總酚酸工藝參數為液固比40∶1，乙醇濃度(V/V)60%，提取時間120 min，提取1次。按照優選的工藝參數平行提取5次，平均提取率為3.75%，RSD=1.41%，說明此工藝合理可行。

蛇莓作為貴州少數民族地區常用藥材，臨床應用廣泛，其活性成分種類較多，尤其是黃酮類和酚酸類活性較強。但考慮到中草藥的習慣用法是水煎法，其活性成分并不能有效提取，造成資源浪費。各類活性成分的藥理作用也不盡相同，分別提取單一成分對提高臨床用藥的有效性、安全性有重要作用。本研究對提取的蛇莓總酚酸進行純化，得到高純度的蛇莓總酚酸，可為進一步藥效學實驗研究提供物質基礎，促進蛇莓藥用價值的發掘與利用。