基于UPLC-LTQ-Qrbitrap代謝組學(xué)技術(shù)的不同產(chǎn)地黃芩組分比較研究

吳樣明，邵 堅(jiān)，孫函靜，甘 俠，余明鏡，季巧遇，2*

(1.江中藥業(yè)股份有限公司，江西 南昌 330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

黃芩為唇形科植物ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒的功效，臨床中常用于治療濕溫、暑濕、胸悶嘔惡、濕熱痞滿等病癥[1]。黃芩主要產(chǎn)于我國黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古等地；其中熱河黃芩以藥效好、品質(zhì)佳而被市場認(rèn)可，是屬于河北承德產(chǎn)的道地藥材[2]。不同產(chǎn)地黃芩資源物質(zhì)基礎(chǔ)存在一定的差異，僅通過單個(gè)指標(biāo)黃芩苷進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)有一定局限性，不利于黃芩的臨床應(yīng)用和研究。不同產(chǎn)地的黃芩與傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)熱河黃芩內(nèi)在的物質(zhì)基礎(chǔ)是否一致仍然不確定，故對道地黃芩與其他產(chǎn)區(qū)黃芩的物質(zhì)內(nèi)涵進(jìn)行一致性評價(jià)非常重要。本研究基于LTQ-Orbitrap技術(shù)對道地藥材熱河黃芩與山西聞喜、陜西澄城黃芩進(jìn)行代謝組學(xué)分析，旨在揭示不同產(chǎn)地黃芩與道地產(chǎn)區(qū)黃芩中化學(xué)組分的一致性和差異性，為黃芩道地藥材化學(xué)表征及優(yōu)勢資源篩選提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 材料

黃芩藥材來自河北承德縣、山西聞喜縣、陜西澄城縣，每個(gè)產(chǎn)地4個(gè)采集點(diǎn)，且每個(gè)采集點(diǎn)2批次，共24批次黃芩藥材，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器

DionexUitiMate 3000(Thermo Fisher 科技有限公司)，ORBITRAP ELITE 質(zhì)譜儀(Thermo 公司)，MSA224S電子天平(德國Sartorius)，數(shù)控超聲波清洗器(KQ1000KDE型，40 kHz，昆山市儀器超聲有限公司)，碎機(jī)(A11BS025，IKA)。

1.3 試劑

甲醇、乙腈為色譜純級(Merck KGaA公司)，甲酸為質(zhì)譜級(Thermo Fisher 科技有限公司)，超純水(Millipore 公司，美國)。

2 方法

2.1 樣品制備

取本品中粉約0.15 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密量取甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，稱重，用甲醇補(bǔ)足，搖勻，用0.22 μm微孔膜濾過，取續(xù)濾液備用。質(zhì)控樣本(QC樣)為各待測樣品等量混合而成。QC樣本每5針進(jìn)樣結(jié)束后進(jìn)一次樣，用于評估儀器的穩(wěn)定性。

2.2 色譜條件與質(zhì)譜條件

2.2.1 色譜條件 色譜條件：Waters XSelect HSS T3 色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.5 μm)；流動相為0.1% 甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～18 min，8%B→35%B；18～21 min，35%B→60% B；流速0.3 mL·min-1；柱溫40 ℃，進(jìn)樣量2 μL。

2.2.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件：FT Orbitrap 質(zhì)量檢測器，電噴霧(ESI) 離子源，噴霧電壓4.0 kV，管狀透鏡電壓110 V，掃描范圍m/z100～800；毛細(xì)管溫度350 ℃；鞘氣流量為30 Psi；輔助氣流量為10 Psi；樣品進(jìn)行全掃描，分辨率R設(shè)為30 000；二級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴性掃描，從上一級峰度最高的3個(gè)峰選取進(jìn)行CID 碎片掃描。

2.3 數(shù)據(jù)處理

將采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理，其中包括去卷積、校準(zhǔn)、峰對齊、峰提取，獲取數(shù)據(jù)矩陣。將處理的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-P 14.1(Umetrics，ume?，Sweden) 軟件，對數(shù)據(jù)矩陣歸一化、標(biāo)準(zhǔn)化處理，分別進(jìn)行PCA無監(jiān)督分析、正交偏最小二乘-判別分析(orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計(jì)分析。OPLS-DA分析中根據(jù)變量VIP(對分組貢獻(xiàn)值)的大小(VIP> 1，規(guī)格化方法為Par)和組間變化的顯著性(P<0.05)進(jìn)行黃芩產(chǎn)地間差異性代謝產(chǎn)物篩選。

3 結(jié)果

3.1 黃芩代謝物的鑒定

MassBank數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[1]，根據(jù)化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)荷比及碎片離子信息對黃芩成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行指認(rèn)，共推斷鑒定出25個(gè)化合物，詳見表2。

表2 黃芩成分鑒定結(jié)果

3.2 主成分分析(PCA)

圖1 不同產(chǎn)地黃芩樣品PCA得分圖

圖2 不同產(chǎn)地黃芩樣品PCA荷載圖

3.3 河北承德與山西聞喜黃芩樣品代謝差異物分析

圖3 兩產(chǎn)地黃芩OPLS-DA得分圖

圖4 Permutation Test

3.2.2 差異物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)(t-test)的P值(P<0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。如表3所示，共篩選出4種差異代謝差異物，山西聞喜黃芩中Oroxylin A-7-O-glucuronopyranoside量高于河北承德，其余3個(gè)代謝產(chǎn)物均低于河北承德黃芩。

表3 兩產(chǎn)地黃芩樣品差異代謝物鑒定結(jié)果

3.4 河北承德與陜西澄城黃芩樣品代謝差異物分析

圖5 兩產(chǎn)地黃芩OPLS-DA得分圖

圖6 Permutation Test

3.2.4 代謝差異物分析 采用OPLS-DA模型VIP值(VIP>1)，并結(jié)合t檢驗(yàn)(t-test)的P值(P<0.05)來尋找差異性表達(dá)代謝物。如表4所示，共篩選出9種差異代謝差異物，陜西澄城黃芩中Trihydroxy-monomethoxyflavone、Tenaxin I倍性變化高于河北承德，其余7個(gè)代謝產(chǎn)物均低于熱河黃芩。

表4 兩產(chǎn)地黃芩樣品差異代謝物

4 討論

黃芩作為中醫(yī)寒涼藥的代表具有很高藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。植物化學(xué)研究表明黃芩含有黃酮類、揮發(fā)性油、萜類、多糖等多種化學(xué)成分[2-4]，而黃酮類成分被認(rèn)為是黃芩中特征性成分。現(xiàn)代藥理研究黃芩廣泛的藥理活性，具有神經(jīng)保護(hù)作用、抗炎、保肝作用、抗腫瘤、抗菌、抗氧化對免疫系統(tǒng)的作用、對肝臟的保護(hù)作用、抗腫瘤作用、抗菌抗病毒作用、抗氧化作用等藥理作用[5-11]。不同產(chǎn)地來源藥材化學(xué)組分存在差異性，對臨床藥效存在直接的影響。代謝組學(xué)是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分，其特點(diǎn)是以組群指標(biāo)成分分析為基礎(chǔ)，高通量檢測方法和多元數(shù)據(jù)處理為手段。藥用植物中活性成分本質(zhì)上為植物代謝產(chǎn)物，運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)對道地產(chǎn)區(qū)黃芩和其他產(chǎn)地黃芩組分分析有利于黃芩資源評價(jià)。本研究以道地產(chǎn)區(qū)熱河黃芩為控制組，與其他產(chǎn)地黃芩進(jìn)行代謝組進(jìn)行比較分析，通過主成分分析可以清晰判別不同產(chǎn)地黃芩，OPLS-DA分析篩選出熱河黃芩與與其他產(chǎn)地黃芩差異代謝物，為不同產(chǎn)地黃芩物質(zhì)表征及黃芩品質(zhì)評價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)。