基于指紋圖譜技術與主成分分析優化苦參中苦參總堿的提取條件

鑒志剛，葉世蕓*，殷少文，劉 巧，張艷琴

(1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550002；2.貴陽市第三人民醫院，貴州 貴陽 550006；3.貴州得軒堂護康藥業股份有限公司，貴州 貴陽 550008)

苦參總堿是中藥苦參(Sophora flavescens)的提取物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等功效[1]。近年來，除傳統的滲漉法、萃取法[2]及回流法外，微波輔助法[3]、鹽輔助法[4]、超聲法[5]等新技術亦逐步應用于苦參總堿的提取純化中。

由于中藥“多組分”的特點，在中藥質量評價過程中，檢測單一成分或少數幾種成分，難以有效評價中藥質量的優劣[6]。而應用中藥指紋圖譜技術則可極大避免遺漏有效成分，可更加全面反映中藥中化學成分的種類及含量，從而獲取可有效代表中藥化學成分的信息，現已成為國內外廣泛接受的一種中藥質量評價方式[7]。由于中藥化學成分的多樣性及復雜性，各組分權重系數較難確定，因而中藥成分的綜合分析難度較大。主成分分析法(Principal component analysis，PCA)是一種利用降低緯度思想，在少損失甚至不損失原有指標信息的基礎上，把多個指標轉化為少數幾個相互獨立指標的一種定量分析方法，運用主成分分析可通過少數幾個綜合指標反映原始指標的絕大部分信息，達到化繁為簡的目的，指紋圖譜技術結合主成分分析技術已應用于中藥有效成分質量控制[8]、基源種類區別[9]及工藝參數的優化[10]等方面。

本實驗采用正交實驗設計法，以溶劑濃度、提取時間、提取次數、料液比為考察因素，比較乙醇回流法與乙醇超聲法提取苦參總堿的效果差異。采用HPLC法建立苦參總堿粗提取物指紋圖譜，并對其共有峰峰面積進行主成分分析，以主成分分析所得到的總因子得分為評價指標，優選苦參中苦參總堿的最佳提取條件，為苦參質量評價與苦參總堿最佳提取方法的篩選提供思路與依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀(型號：1260 HPLC；廠商：Agilent)；超聲清洗儀(型號：YQ-1000A；廠商：上海易凈超聲波儀器有限公司)；藥典篩(廠商：紹興市上虞張興沙篩廠)；高速多功能粉碎機(型號：HC-S4；廠商：永康市天琪盛世貿有限公司)；色譜柱(規格：4.6 mm×250 mm，5 μm；型號：Welch Ultimate XB-NH2)；電熱鼓風干燥箱(型號：101-1A；生產廠商：天津天泰儀器有限公司)；萬分之一天平(型號：AE240；生產廠商：上海梅特勒有限公司)；旋轉蒸發器(型號：RE-2000B；生產廠商：上海亞榮生化儀器廠)；數顯恒溫水浴鍋(型號：HH-4；生產廠商：常州普天儀器制造有限公司金壇市晶玻實驗儀器廠)；永欣可控低溫電爐(型號：TW-2000W；生產廠商：郫縣永信電器廠)；高速離心機(型號：H2050R；生產廠商：湖南湘儀離心機儀器有限公司)。

1.2 試劑及藥材

苦參采購于藥材市場，經貴州中醫藥大學魏升華教授鑒定為豆科植物苦參(Sophora flavescens)的干燥根；苦參堿對照品(批號：110805-201709)；氧化苦參堿對照品(批號：110780-201909)；槐定堿對照品(批號：110784-201706)；槐果堿對照品(批號：110784-201405)；氧化槐果堿對照品(批號：111652-200301)均購于中國食品藥品檢定研究院，純度均大于98%；乙腈、磷酸、無水乙醇為色譜純，水為“哇哈哈”純凈水，95%乙醇、鹽酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱Welch Ultimate XB-NH2(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-無水乙醇-3%磷酸(85∶7.5∶7.5)，柱溫30 ℃，流速1.0 mL/min，檢測波長220 nm，進樣量10 μL[11]。

2.2 溶液配制

2.2.1 對照品溶液配制 取標準品氧化槐果堿、氧化苦參堿、苦參堿、槐定堿、槐果堿適量，精密稱定，用乙腈-無水乙醇(85∶15)溶解定容。分別配制成含槐果堿 0.018 05 mg/mL、苦參堿 0.074 4 mg/mL、氧化苦參堿 0.318 0 mg/mL、槐定堿 0.149 6 mg/mL、氧化槐果堿 0.152 6 mg/mL的對照品儲備液。

2.2.2 苦參總堿浸膏制備 稱取苦參粉末32份，每份約10.0 g，采取乙醇回流、乙醇超聲2種提取方式，按照表1中條件提取，提取液過濾后，棄去濾渣，濃縮提取液至最小體積，用1%HCl調節濃縮液pH 3～4后過濾，棄去濾渣，續濾液用10%NaOH調節pH 10～11。分別用濾液體積1倍、0.5倍、0.5倍、0.5倍的氯仿進行萃取，收集氯仿層并回收氯仿，95%乙醇溶解后，揮干溶劑，制得稠浸膏。精密稱取浸膏0.6 g，5 mL無水乙醇溶解后，精密量取溶液1.0 mL至25 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，備用。

表1 乙醇回流法、超聲法設計因素與水平

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取乙醇回流正交實驗1號提取條件下供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.73%～1.32%，相對峰面積的RSD為0.88%～2.70%。這說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.4.2 穩定性試驗 取乙醇回流正交實驗1號提取條件下供試品溶液，分別于0、1、2、3、5、8 h按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.77%～1.88%，相對峰面積的RSD為0.47%～1.88%。結果表明，供試品在8 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取乙醇回流正交實驗1號提取條件下供試品溶液，重復制備6次，按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，計算各共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD為0.31%～1.16%，相對峰面積的RSD為1.79%～2.70%。結果表明，供試品制備方法重復性良好。

2.5 苦參HPLC指紋圖譜的建立

取混合對照品溶液及“2.2.2”項下按正交實驗表配制的供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定并記錄色譜圖，利用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版》軟件進行分析，設定S1為參照色譜，對色譜峰進行多點校正及數據匹配，時間寬度為0.1 min，生成苦參HPLC指紋圖譜疊加圖。結果顯示，在不同提取工藝產生的指紋圖譜中，共確定12個共有峰，通過與混合對照品色譜圖比對相對保留時間，可確定2號峰為槐果堿、4號峰為苦參堿、6號峰為氧化槐果堿、10號峰為槐定堿、11峰為氧化苦參堿。見圖1、圖2、圖3、圖4。

圖1 混合對照品HPLC色譜

圖 2 空白對照色譜

圖3 乙醇回流法特征峰匹配圖譜

圖4 乙醇超聲法特征峰匹配圖譜

2.6 指紋圖譜主成分分析

2.6.1 主成分提取及貢獻率計算 采用SPSS 26.0統計軟件對正交實驗下不同提取方式的各組樣品峰面積進行主成分分析法降維處理，提取特征值λ>1的特征根相應成分為主成分，獲取可代表原始峰面積的主成分及相應貢獻率，主成分總方差的解釋見表2、表3，結果顯示，兩種不同提取方法下分別選取了3～4個主成分，累計方差貢獻率分別為88.098%、90.647%，滿足主成分累計方差貢獻率達85%的要求，說明提取的主成分可以代表原始色譜峰峰面積的絕大部分信息。

表2 乙醇回流法主成分總方差解釋

表3 乙醇超聲法主成分總方差解釋

2.6.2 綜合評價[12]運用SPSS 26.0統計軟件分別計算兩種不同提取方式選取的各個主成分得分，即F1=主成分1的成分得分系數/初始特征值的算術平方根，以此類推分別算出各個主成分的得分，再根據特征向量推導出不同提取方式的主成分綜合得分方程：F乙醇回流法=0.689 26F1+0.189 45F2+0.124 30F3，F乙醇超聲法=0.672 94F1+0.121 33F2+0.106 19F3+0.099 55F4，按照公式分別計算不同提取條件下不同樣品的綜合得分。見表4。

表4 不同提取條件下PCA綜合得分

2.7 正交實驗工藝優化

本研究選取乙醇濃度(A)、提取時間(B)、提取次數(C)、液料比(D)等4個因素作為考察對象，以各個樣品綜合得分為評價指標，進行正交實驗直觀分析與方差分析，正交實驗結果與直觀分析結果見表5、表6，方差分析結果見表7、表8。

表5 乙醇回流法正交實驗直觀分析結果

表6 乙醇超聲法正交試驗直觀分析結果

表7 乙醇回流法正交試驗方差分析結果

表8 乙醇超聲法正交試驗方差分析結果

從正交實驗直觀分析結果看，兩種提取方式下4種因素均對提取效果產生一定影響，乙醇回流提取條件下影響因素A>C>D>B，乙醇超聲提取條件下影響因素C>D>B>A，從方差分析結果看，乙醇回流提取方式下A因素對提取效果影響最大，其次是C，再次為D，最小為B，而各個因素對提取效果均無顯著影響，考慮到提取效率及生產成本，確定最優組合為A4B1C1D4(13倍90%乙醇，回流提取60 min，共提取1次)，乙醇超聲提取方式下對提取效果影響最大的因素為C，其次為D、B，最小為A，而除了C因素外，其他因素對提取效果無明顯作用，考慮到實際提取效率及生產成本，確定最優組合為A3B1C4D1(10倍85%乙醇，超聲提取60 min，共提取4次)。兩種提取方式相比，乙醇回流提取方式下藥材長期處于加熱狀態下易導致苦參生物堿結構發生變化[13]，影響產出的苦參總堿質量，故綜合考慮提取效率、生產成本、產品安全性等方面，采用乙醇超聲條件下最優組合提取苦參總堿。

2.8 驗證實驗

取苦參粉末約10.0 g，精密稱定，按上述正交實驗優化的工藝平行制備6份，按“2.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示，各共有峰相對保留時間的RSD均小于1.2%，相對峰面積RSD均小于2.3%，且綜合分析各共有峰面積得到6份樣品的綜合得分為2.6，表明實驗穩定性好，得到的最佳提取工藝穩定、切實可行。

3 討論

中藥指紋圖譜技術是一種整體、綜合、可量化反映藥物內部較多活性成分的定性、定量方法，其主要以色譜峰的相對保留時間及相對峰面積進行定性，以色譜峰面積進行半定量，近年來常用于中藥質量評價與控制[14-18]。本研究選用L16(44)正交實驗，建立乙醇超聲法、乙醇回流法兩種提取條件下苦參指紋圖譜，分別確定了12、12個共有峰，利用SPSS 26.0統計軟件對共有峰峰面積進行了主成分分析法降維分析，分別確定了4、3個可代表原始共有峰信息的主成分，以其綜合得分為評價指標進行正交實驗直觀分析與方差分析，比較兩種提取方法分析結果，優選出苦參最佳提取工藝參數，得出供試品提取時使用10倍 85%乙醇超聲提取4次，60 min/次的提取優化方案，為苦參總堿最佳提取方法的篩選提供了思路與依據，但受制于實驗規模及相關技術條件，實驗室g級樣品優選的最佳提取工藝在中試中是否還應保持一致仍需深入研究。

溶劑提取法是苦參中苦參總堿提取的常用基本方法，其操作簡單，成本低，適于工業化生產，超聲輔助提取技術可使藥物細胞壁破裂，加速有效成分溶出，提高提取效率，縮短提取時間，在苦參總堿提取中發展前景良好[19]。2015年版《中華人民共和國藥典》中采用氯仿作為溶媒，超聲法提取苦參堿，具有較好的提取效果[11]，但考慮到氯仿對人體心、肝、腎等器官有一定損害，具有一定危險性，故本研究采用安全性較高的乙醇作為溶劑，減少苦參總堿分離純化過程中可能產生的有毒溶劑殘留，提高了實驗安全性。通過對色譜條件的考察，進行全波長掃描[20]，結果顯示，在220 nm時吸收最大，檢出峰各峰比例合適，基線較平穩，可基本反映出苦參中苦參總堿的整體面貌，故選擇以220 nm作為檢測波長。

本研究建立了苦參生物堿指紋圖譜，采用HPLC法以主成分分析得到的總因子得分為評價指標，而有研究者對苦參提取工藝進行優化時選用滴定法測定苦參總堿的含量，以苦參總堿含量為指標進行提取工藝優化，但滴定法專屬性不強，滴定終點的判斷易受主觀因素影響，人為誤差較大，影響實驗結果的準確性[21]。HPLC法準確度好，專屬性強，不易受雜質干擾，可全面覆蓋苦參中大部分有效成分，全面性與綜合性強，可更好地控制苦參總堿的質量與提取效果。

本研究將指紋圖譜技術與化學計量法相結合用于中藥苦參提取工藝優化，全面考察了藥材提取狀況的同時又簡化了數據，便于分析，具有一定的實用性與適用性。