基于UPLC特征圖譜及主要成分含量測定的百合藥材初加工方法研究

張 正，陳江平，鐘 霞，徐東婷，胡 懿，程學(xué)仁

(廣東一方制藥有限公司 廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244)

百合為百合科植物卷丹LiliumlancifoliumThumb.、百合LiliumbrowniiF.E.Brown var.viridulumBaker，或細(xì)葉百合LiliumpumilumDC.的干燥肉質(zhì)鱗葉，具有養(yǎng)陰潤肺、清心安神的功效，用于陰虛燥咳、勞嗽咳血、虛煩驚悸、失眠多夢、精神恍惚等證[1]。百合始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品，為常用中藥材，也是原國家衛(wèi)生部2002年確定的藥食同源品種之一[2-4]。研究[5-9]表明，百合中主要含有皂苷類、酚性甘油酯類、多糖類、磷脂類、生物堿類等活性成分，具有止咳祛痰、鎮(zhèn)靜催眠、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗應(yīng)激損傷、抗氧化等藥理作用，其中，王百合苷B為百合酚性甘油酯類成分之一[6]，王百合苷B在百合藥材中相對百分含量較高，水溶性好，為百合基礎(chǔ)物質(zhì)的主要成分之一。2015年版《中華人民共和國藥典》百合項下僅有性狀、薄層鑒別及浸出物的質(zhì)量要求，本研究旨在建立百合藥材王百合苷B含量測定方法及UPLC特征圖譜方法，為百合藥材的質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。

初加工是影響中藥材質(zhì)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，2015年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定百合鮮品的初加工方法為“秋季采挖，洗凈，剝?nèi)△[葉，置沸水中略燙，干燥”，筆者于安徽、湖南、浙江等百合主產(chǎn)區(qū)走訪調(diào)研發(fā)現(xiàn)，百合的初加工方法除燙制法外，還有蒸制法、冷水浸泡法及直接干燥法，其初加工方法無規(guī)范化技術(shù)指南，這是導(dǎo)致百合藥材質(zhì)量差異的重要因素[10-13]。本研究以外觀性狀、浸出物、王百合苷B含量及UPLC特征圖譜為評價指標(biāo)，比較直接烘干法、冷水浸泡法、燙制法及蒸制法對百合藥材質(zhì)量的影響，為百合初加工的規(guī)范化操作提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695高效液相色譜儀(美國Waters公司)；Waters H-Class高效液相色譜儀(美國Waters公司)；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

1.2 試劑與藥物

王百合苷B對照品(批號：114420-66-5，南京世洲生物技術(shù)有限公司，純度>98%)；磷酸和乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

18批百合藥材的產(chǎn)地信息見表1，產(chǎn)地加工方法各異，洗凈剝片，開水燙或蒸，以鱗片邊緣柔軟而中部未熟，背面有極小的裂紋為度，無統(tǒng)一方法。鮮百合樣品于2019年8月采自湖南省湘西土家族苗族自治州龍山縣，所有樣品經(jīng)廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定為正品，基原為卷丹，樣品存放于廣東一方制藥有限公司。

表1 18批百合藥材產(chǎn)地信息

2 評價指標(biāo)測定方法

2.1 水分測定

按照水分測定法(2015年版《中華人民共和國藥典》[14]四部通則0832)項下的第二法測定。

2.2 浸出物測定

按照浸出物測定法(2015年版《中華人民共和國藥典》[14]四部通則2201)項下水溶性浸出物測定法的冷浸法和醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定。

2.3 王百合苷B含量測定

2.3.1 色譜條件 Waters XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(19∶81)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量10 μL，檢測波長312 nm。色譜見圖1。

注：A.對照品溶液；B.供試品溶液；1.王百合苷B。

2.3.2 對照品溶液制備 取王百合苷B對照品適量，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加甲醇制成每1 mL含王百合苷B 292.352 μg的溶液，即得。

LAS方法和本文方法的迭代過程如表5和表6所示?？梢钥闯?，由于考慮了克里金近似的誤差，本文方法的局域半徑稍大于LAS方法，采樣效率更高，求解精度也更好。

2.3.3 供試品溶液制備 取百合藥材粉末(過三號篩)約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入稀乙醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足損失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取濃度為292.352 μg·mL-1的王百合苷B對照品溶液1 mL，分別置于1、2、5、10、25、50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.3.1”項下色譜條件測定，以峰面積為縱坐標(biāo)，對照品濃度為橫坐標(biāo)，得王百合苷B回歸方程：Y=29 985.878 3X-107 432.617 7(r=0.999 1)，線性范圍為5.847～292.352 μg·mL-1。

2.3.5 精密度試驗 精密吸取王百合苷B的對照品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，王百合苷B的峰面積RSD為2.52%，說明儀器精密度良好。

2.3.6 重復(fù)性試驗 取百合藥材樣品粉末(S7)，稱取6份，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算王百合苷B含量的RSD為0.93%，說明該方法的重復(fù)性良好。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取百合藥材樣品(S7)，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算王百合苷B含量的RSD為0.30%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.8 加樣回收試驗 取已知含有量的百合藥材樣品(S7)粉末適量，精密稱取9份，每份約1.0 g，置于具塞錐形瓶中，分為3組，每組分別精密加入相當(dāng)于含有量50%、100%、150%的王百合苷B對照品溶液，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件測定，計算平均加樣回收率為103.84%，RSD為1.6%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。見表2。

表2 王百合苷B加樣回收實驗 (n=9)

2.4 UPLC特征圖譜方法建立

注：C.對照品溶液；D.供試品溶液；7.王百合苷B。

2.4.2 對照品溶液制備 同“2.3.2”項。

2.4.3 供試品溶液制備 同“2.3.3”項。

2.4.4 精密度試驗 取“2.4.3”項下S3供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以7號峰王百合苷B為參照峰，計算各色譜峰相對保留時間的RSD在0.05%～0.11%，相對峰面積的RSD為0.41%～1.89%，說明儀器精密度良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗 取同一批百合藥材S3，按“2.4.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，以7號峰王百合苷B為參照峰，計算各色譜峰相對保留時間的RSD在0.04%～0.10%，相對峰面積的RSD為1.41%～2.18%，說明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.3”項下S3供試品溶液，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.4.1”項下色譜條件測定，以7號峰王百合苷B為參照峰，計算各色譜峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.14%，相對峰面積的RSD為1.95%～2.52%，說明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.7 特征圖譜建立及色譜峰歸屬 取百合藥材S1-S18，按“2.4.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件測定，記錄色譜圖，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2012版)進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，18批百合藥材共有7個分離較好的特征峰，其UPLC特征圖譜見圖3。通過與對照品色譜圖對照，確定7號峰為王百合苷B，見圖4。以7號峰王百合苷B為參照峰，計算其他特征峰的相對保留時間及相對峰面積，見表3、表4。

圖3 18批百合藥材UPLC特征圖譜疊加

注：7.王百合苷B。

表3 18批百合藥材共有峰相對保留時間

表4 18批百合藥材共有峰相對峰面積

3 研究內(nèi)容與結(jié)果

3.1 樣品制備

取鮮百合樣品，進(jìn)行剝片、清洗、瀝水、混勻，再進(jìn)行不同初加工方法處理。見表5。

表5 百合樣品加工方式與性狀

3.2 百合樣品水分與浸出物測定

取“3.1”項下百合樣品，按“2.1”及“2.2”項下方法測定，結(jié)果見表6。

表6 百合樣品水分與浸出物測定結(jié)果 (n=3)

3.3 含量測定

取“3.1”項下百合樣品，按“2.3”項下方法測定，結(jié)果見表7。

表7 百合樣品王百合苷B含量測定結(jié)果 (n=3)

3.4 特征圖譜測定

取“3.1”項下樣品，按“2.4”項下方法測定，各樣品的相對保留時間與相對峰面積見表8、表9，UPLC特征圖譜見圖5。

圖5 百合樣品UPLC特征圖譜疊加

表8 百合樣品特征圖譜共有峰相對保留時間

表9 百合樣品特征圖譜共有峰相對峰面積

4 討論

在百合藥材UPLC特征圖譜測定方法建立過程中，比較了不同提取溶劑(甲醇、50%甲醇、80%甲醇、乙醇、稀乙醇、80%乙醇)，不同提取方法(超聲、回流)，不同提取時間(15、30、45 min)及不同溶劑體積(10、25、50、100 mL)對百合藥材特征圖譜的影響，結(jié)果表明，提取溶劑對百合藥材特征峰的影響較大，以稀乙醇25 mL，超聲處理(功率300 W，頻率45 kHz)30 min的提取效果最佳。相比傳統(tǒng)的HPLC，UPLC具有分析時間短、流動相消耗少、靈敏度高及分離度好等優(yōu)勢，為中藥復(fù)雜成分的分離和解析提供了較好方法，本研究建立的UPLC特征圖譜測定方法可在20 min內(nèi)完成檢測，操作簡便，可提供較為豐富的組分群信息，綜合評價百合藥材的質(zhì)量。

2015年版《中華人民共和國藥典：一部》百合項下規(guī)定百合藥材表面黃白色至淡棕黃色，有的微帶紫色，斷面較平坦，呈角質(zhì)樣。不同初加工方法百合樣品的外觀性狀方面，直接烘干與冷水浸泡樣品均為棕褐色，燙制及蒸制樣品均為黃白色，但沸水燙12、16 min及蒸16 min的樣品明顯糊化，且干燥后呈粉性而非角質(zhì)樣。因此，直接烘干法及冷水浸泡法加工的樣品性狀不符合《中華人民共和國藥典》要求，燙制2～8 min及蒸制2～12 min的樣品性狀符合《中華人民共和國藥典》要求。文獻(xiàn)[15]表明，百合含有大量黃酮及酚類化合物，采收后極易變色，利用高溫制熟可抑制百合內(nèi)活性酶的作用，防止酶促褐變，可更好保持其色澤及營養(yǎng)成分。因此，直接烘干及冷水浸泡的樣品外觀會呈棕褐色可能是未經(jīng)高溫制熟所致。

在不同初加工方法制備的百合樣品的內(nèi)在質(zhì)量方面，浸出物測定結(jié)果表明，4種初加工方法百合樣品的水溶性浸出物為27.09%～33.98%，醇溶性浸出物為2.59%～4.57%，無明顯變化規(guī)律和差異。王百合苷B含量測定結(jié)果表明，鮮百合的王百合苷B含量為0.083 9%，直接烘干樣品的含量為0.007 9%，下降顯著。冷水浸泡樣品的王百合苷B含量隨浸泡時間增加呈明顯下降趨勢，當(dāng)浸泡時間達(dá)6 h時，與鮮百合相比，其含量下降幅度達(dá)84.9%。燙制與蒸制樣品的含量較鮮品含量均在2 min時顯著升高，并在4 min后趨于平衡。燙制和蒸制樣品的王百合苷B含量顯著高于百合鮮品、直接烘干與冷水浸泡樣品的王百合苷B含量，這可能與燙制、蒸制過程中均有高溫受熱有關(guān)。特征圖譜測定結(jié)果表明，直接烘干及冷水浸泡百合樣品均出現(xiàn)4號特征峰丟失，而百合鮮品、燙制和蒸制百合樣品的特征圖譜均正常，與不同產(chǎn)地18批百合藥材的特征圖譜基本一致，說明直接烘干法和冷水浸泡法會導(dǎo)致百合藥材中部分特征成分丟失。因此，為保證百合藥材質(zhì)量，其初加工應(yīng)避免使用直接烘干法及冷水浸泡法，建議選擇沸水燙制4～8 min或蒸制4～12 min。