三顆針炮制前后肝損傷保護及體外抗氧化作用比較研究

李 香，李雪營，鄧先擴，許義紅，唐方方，劉 杰

(黔南民族醫(yī)學高等專科學校，貴州 都勻 558000)

三顆針Berberidis Radix為小檗科植物小黃連刺BerberiswihonaeHemsl.、匙葉小檗BerberisvernaeSchneid.、細葉小檗BerberispoiretiiSchneid.、擬豪豬刺BarberissoulieanaSchneid.等同屬植物干燥根，含小檗堿、藥根堿、巴馬汀等多種生物堿，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。在貴州苗族聚集區(qū)，其被用于降血糖、抗菌、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化等[1-2]。由于三顆針資源豐富，采集方便，常代替黃連、黃柏藥用。民間常將三顆針經酒制、醋制等炮制后使用[3]。研究發(fā)現，三顆針不同炮制方法對生物堿含量有一定影響，但炮制對其保肝、抗氧化作用的影響如何，尚未見相關報道。因此，本實驗通過比較三顆針炮制前后在保肝、抗氧化上的作用，為三顆針開發(fā)應用提供參考依據，現報道如下。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠，雄性，體質量18～22 g，由中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號SCKK(軍)2012-2011。適應期喂養(yǎng)3 d，自由攝食與飲水。

1.2 藥材與試藥

三顆針采于貴州省福泉，經黔南民族醫(yī)學高等專科學校魏學軍教授鑒定為擬豪豬刺BarberissoulieanaSchneid.干燥根。經測定符合2015版《中華人民共和國藥典：一部》要求。丙二醛(MDA)試劑盒(批號：20191016)、超氧化歧化酶(SOD)試劑盒(批號：20191015)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：20191015)、谷草轉氨酶(AST)試劑盒(批號：20191017)、谷丙轉氨酶(ALT)試劑盒(批號：20191017)，所有試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；聯苯雙酯滴丸(北京協和藥廠，批號：H11020980)；硫酸亞鐵(無錫市亞泰聯合化工有限公司，批號：GB/T664-1998)；水楊酸(天津市科密歐化學試劑有限公司，批號：Q/12HB3705-2018)；抗壞血酸(上海辰云化工有限公司，批號：190310)；H2O2(江西草珊瑚消毒用品有限公司，批號：20190403)；1，1-二苯基-2-三硝基肼自由基(合肥巴斯夫生物科技有限公司，批號：Y0303-100MG)；紅星二鍋頭56°(北京紅星股份有限公司，批號：GB/710781.2C級)；橄欖油(福建省嘉成生物科技有限公司，批號：SC10235012101843)。其余試劑均為分析純。

1.3 儀器

KQ3200DV超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司)；RE52AA旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；DHG-9240A真空干燥箱(上海金山公司)；DRHH-S4(上海雙捷實驗設備有限公司)；DRHH-S4數顯恒溫水浴鍋(上海雙捷實驗設備有限公司)；MR-96A酶標儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；01040080型紫外分光光度計(上海儀電分析儀器有限公司)；AF240型電子天平(瑞士METTLER)；0412-1型離心機(上海手術器械廠)。

2 方法

2.1 飲片炮制[4-5]

2.1.1 生品 取三顆針凈制藥材，切片，干燥備用。

2.1.2 醋制品 取凈制三顆針藥材180 g，分成3份，每份約60 g，加入30%米醋(18 mL)，悶潤1.5 h，放入真空干燥箱，于160 ℃烘制20 min，取出備用。

2.1.3 酒制品 取凈制三顆針藥材180 g，分成3份，每份約60 g，加入30%黃酒(18 mL)，悶潤1 h，放入真空干燥箱，于160 ℃烘制20 min，取出備用。

2.2 保肝作用

2.2.1 各制品溶液制備 稱取生品、醋制品、酒制品各40 g，每種制品各3份。分別加入10倍量甲醇，超聲提取(功率250 W，頻率20 kHz)2次，每次1 h，抽濾，合并濾液，減壓回收甲醇，濃縮液80 ℃水浴蒸干，浸膏真空干燥。根據預實驗與生藥用量，用0.5%CMC-Na溶解各制品浸膏，分別制得濃度為2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1高低劑量組藥液，即得各制品溶液。

2.2.2 各對照組藥液制備 用0.5%CMC-Na溶解聯苯雙酯滴丸內容物，配制成濃度為150 mg·mL-1陽性對照組溶液。0.5%CMC-Na溶液為正常對照組溶液。

2.2.3 對CCI4致小鼠肝損傷的保護作用[6-7]取90只雄性小鼠，隨機分成9組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，三顆針各制品高、低劑量組(2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1)，聯苯雙酯組。按照20 mL·kg-1體積灌胃給藥，正常對照組與模型組均給予等量0.5%CMC-Na溶液，每天灌胃1次，連續(xù)灌胃7 d。末次給藥2 h后，除正常對照組外，其余各組小鼠均腹腔注射0.2%CCI4的橄欖油溶液20 mL·kg-1。禁食不禁水16 h后，稱重，眼眶取血，小鼠脫臼處死，解剖取肝臟。

2.2.4 對白酒致小鼠肝損傷的保護作用[8]取90只雄性小鼠，隨機分成9組，每組10只，分別為正常對照組，模型組，三顆針各制品高、低劑量組(2.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1)，聯苯雙酯組。正常對照組每天灌胃0.5%CMC-Na溶液，其余各組每天灌胃56°紅星二鍋頭6 mL·kg-1，0.5 h后，按照20 mL·kg-1體積灌胃給藥，正常對照組與模型組均給予等量0.5%CMC-Na溶液，其余各給藥組灌胃給藥，連續(xù)10 d。末次給藥后禁食不禁水12 h，稱重，小鼠脫臼處死，解剖取肝臟。

2.2.5 生化指標檢測 肝臟指數計算：將“2.2.3”與“2.2.4”項下解剖的肝臟，用冰生理鹽水洗去殘留血跡，除去結蹄組織，濾紙吸干水分，稱重，計算肝臟指數。

肝臟指數(%)=肝質量(g)/小鼠體質量(g)×100%

血清及肝組織活力測定：將“2.2.3”項小鼠眼眶取血后，放置2 h，以3 000 r·min-1速度離心15 min，分離出血清，按照試劑盒要求測定AST、ALT的活性。將“2.2.4”項小鼠解剖肝臟，取肝臟組織約0.2 g，加1.8 mL冰生理鹽水，制成10%肝組織勻漿，以3 000 r·min-1速度離心15 min后取上清液，按照試劑盒要求測定MDA水平與SOD、GSH-Px活性。

2.3 體外抗氧化活性

2.3.1 清除羥自由基能力測定[9]取10 mL具塞試管，分別加入3 mmoL/L硫酸亞鐵溶液2 mL、6 mmoL/L水楊酸-乙醇溶液2 mL，加入不同體積三顆針生品、酒制品、醋制品供試品溶液并定容到6 mL，加入1 mmoL/L過氧化氫溶液2 mL，搖勻于37 ℃水浴中反應30 min。于510 nm波長處測定吸光度AX，同法測定不加樣液、過氧化氫的吸光度A0與AX0。均用蒸餾水作參比溶液。平行操作3次，按照：羥自由基清除率(%)=[A0-(AX-AX0)]/A0×100，計算羥自由基清除率。

2.3.2 清除DPPH測定[10]精密稱定DPPH 10.03 mg于25 mL棕色瓶，用70%乙醇超聲溶解并定容至刻度，搖勻備用。取10 mL具塞試管，加入不同體積的三顆針生品、酒制品、醋制品供試品溶液，加入DPPH溶液0.5 mL。用70%乙醇定容至5 mL，搖勻，室溫暗處反應1 h，以乙醇作空白對照，于522 nm處測定吸光度值A1，DPPH溶液0.5 mL70%乙醇定容至5 mL及各不同體積供試品溶液吸光度A0及A2，平行操作3次，按照：DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100，計算DPPH自由基清除率。

2.4 數據分析

3 結果與分析

3.1 對CCI4致小鼠肝損傷血清生化指標及肝臟指數的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠血清的AST與ALT活性及肝臟指數有顯著性升高(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組比較，三顆針各制品各劑量均可顯著性降低小鼠肝損傷血清中的ALT活性(P<0.01)。除生品低劑量組外，其余各組均可顯著性降低AST活性(P<0.01)。除生品與酒制品低劑量組外，其余各組可顯著性降低小鼠肝臟指數，說明三顆針各制品對小鼠肝損傷肝腫脹具有一定緩解作用。見表1。

表1 三顆針各制品對小鼠肝損傷血清ALT、AST及肝臟指數的影響

3.2 對白酒致小鼠肝損傷肝組織中MDA水平及SOD、GSH-Px活性及肝臟指數的影響

與正常對照組比較，模型組小鼠肝臟肝組織中MDA水平顯著性升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性顯著性降低(P<0.01)，說明實驗造模成功。與模型組比較，三顆針各制品可顯著性降低MDA水平(P<0.01)，除生品、酒制品、醋制品低劑量外，其余各組可升高SOD、GSH-Px活性。酒制品、醋制品高劑量組可顯著性降低小鼠肝臟指數，說明對小鼠肝損傷肝腫脹具有一定緩解作用。見表2。

表2 三顆針各制品對小鼠肝組織中各活性水平及肝臟指數的影響

3.3 體外抗氧化作用、清除羥自由基與DPPH測定

按照“2.3.1”與“2.3.2”項下操作，測定Vc、生品、酒制品、醋制品對羥基自由基與DPPH的清除率，隨著濃度增加，對羥基自由基與DPPH的清除率也隨之升高，根據各濃度清除率，計算其IC50，結果見表3。

表3 三顆針各制品體外抗氧化性能力的測定

4 討論

三顆針含小檗堿、藥根堿、巴馬汀等多種生物堿，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。在貴州都勻主要用于降血糖、抗菌、鎮(zhèn)痛、保肝、抗氧化等。三顆針有生品、酒制品、醋制品等加工炮制應用。前期研究已確定三顆針酒制、醋制加工炮制工藝，且研究表明含有小檗堿、藥根堿等生物堿成分的中藥具有保肝、抗氧化作用。而三顆針加工炮制對保肝與抗氧化作用的影響鮮見報道。

通過查閱文獻，白酒與CCI4致小鼠急性肝損傷是比較經典的肝損傷模型，白酒與CCI4在體內酶作用下，生成一系列自由基，自由基通過與脂肪酸的過氧化反應，使肝細胞的AST與ALT等大量釋放，導致血清中AST與ALT急劇上升，因此，臨床上把AST與ALT水平作為判斷肝損傷程度的診斷指標。生物機體內具有GSH-Px與SOD等重要抗氧化酶，具有一定的抗氧化能力，MDA水平高低可以反映體內脂質過氧化的高低。

維生素C是一種天然抗氧化劑，主要來源于食品與藥品，是人體不可缺少的維生素之一。VC可以清除羥基自由基、DPPH自由基等。本實驗選取VC作為陽性對照考察三顆針各制品的抗氧化活性。

結果表明，三顆針各制品對小鼠肝損傷肝腫脹具有一定緩解作用，各制品可顯著性降低CCI4致小鼠肝損傷血清中的ALT與AST活性(P<0.01)，各制品可升高白酒致小鼠肝損傷肝組織SOD、GSH-Px活性，與劑量存在相關性。與生品比較，酒制品、醋制品顯著性降低MDA水平(P<0.01)。三顆針抗氧化活性大小為：醋制品>酒制品>生品。

綜上，三顆針各制品具備一定的保肝與抗氧化活性，并呈一定劑量相關性。炮制后的保肝與抗氧化活性明顯增強，研究表明，三顆針酒制及醋制后，其鹽酸小檗堿與鹽酸藥根堿含量明顯增加。而小檗堿、藥根堿等生物堿具有一定的保肝與抗氧化作用，這可能是三顆針炮制后的保肝與抗氧化作用優(yōu)于生品的原因之一，今后將對其作用機制進行深入研究，為三顆針及炮制品的開發(fā)利用奠定堅實基礎。