超高效液相色譜-串聯質譜法測定不同pH值溶液中三葉苷平衡溶解度和表觀油水分配系數*

張遠冬，高健美，龔其海

(遵義醫科大學1.藥學院；2.基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，遵義 563000)

三葉苷是從多穗柯中分離出的一種二氫查爾酮化合物，其結構為根皮素-4’-β-D-葡萄糖苷。在甜茶嫩葉中，三葉苷含量為82.9 ～ 103.1 mg·g-1，是含量最高的活性成分[1]。藥理學研究表明，三葉苷能明顯抑制α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶活性，進而有效降低大鼠的血糖水平[2]；同時，三葉苷下調腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6表達水平，并抑制其分泌，具有減輕內毒素誘導的炎癥反應的作用[3]。研究發現，三葉苷能夠清除細胞內和線粒體內過多的氧自由基，提高抗氧化物酶活力，對過氧化氫(H2O2)誘導的PC12細胞氧化應激損傷具有保護作用[4]；進一步的體內研究顯示，三葉苷灌胃給予局灶性腦缺血-再灌注損傷模型大鼠后，可顯著抑制大鼠大腦中動脈栓塞后神經炎癥和氧化應激損傷，從而有效改善大鼠大腦急性缺血造成的神經功能缺陷，并減小腦缺血梗死體積[5]。這些研究表明，三葉苷具有較好的潛力開發應用于炎癥、缺血性腦卒中等疾病的治療。

然而，三葉苷水溶性極低，在實驗中存在給藥困難以及給藥劑量不準確的問題；在體內研究中，常常需要口服給予大劑量的藥物才能發揮治療作用[5]。這些因素極大限制了三葉苷的研究及應用。因此，探明三葉苷的基本理化性質，并研發合適的藥物新制劑，提高三葉苷溶解度極為重要。目前，關于三葉苷的文獻報道多集中于提取工藝及藥理學研究，而對三葉苷理化性質研究鮮有報道。筆者通過建立超高效液相色譜-串聯質譜(ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry，UPLC-MS/MS)方法準確測定三葉苷的含量，并結合飽和溶液法和搖瓶法測定三葉苷在不同pH值溶液中的平衡溶解度及油水分配系數[6-7]，初步考察其溶解性和滲透性，為后續三葉苷體內生物利用度、藥動學研究以及藥物新制劑的設計和制備提供參考。

1 儀器與試劑

1.1儀器 Triple TOF 4600高分辨質譜系統(美國ABSCIEX公司)；LC-30AD超高效液相系統(日本Shimadzu公司)；電子天平(德國Sartorius公司，感量：0.01 mg)；Cary 300紫外-可見分光光度計(美國Varian公司)；Mettler Toledo pH值計(瑞士)；UPH-II-10T 優普超純水儀 (西安優普儀器設備有限公司)；Allegra TM X-22R離心機(美國貝克曼公司)；TCYQ水浴恒溫振蕩器(江蘇太倉實驗設備廠)；孔徑0.45 μm微孔濾膜(杭州馳騁醫藥科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 三葉苷對照品(南京澤郎生物科技有限公司，批號：161009，含量≥98%)；色譜級乙腈(美國Sigma公司)；甲醇、正辛醇、甲酸、磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉等均為優級純(阿拉丁、成都依云化工原料有限公司)。

2 方法與結果

2.1色譜條件 超高效液相檢測條件為：系統選用Kinetex XB-C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流動相為0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脫程序：起始B為10%并持續1.00 min；1.00～8.00 min B變為80%，并持續至12.00 min；12.01 min B變為10%并持續至15.00 min。流速為300 μL·min-1；柱溫為30 ℃。

2.2質譜條件 Triple TOF 4600高分辨質譜系統采用電噴霧電離離子源，分別采用Positive離子化方式；質量掃描范圍m/z100～1000；鞘氣為379 kPa，輔助氣為379 kPa；氣簾氣為172 kPa，霧化溫度600 ℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA掃描模式，TOF/MS一級預掃描和觸發的二級掃描Product Ion-IDA離子累積時間分別為250，100 ms，解簇電壓80 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為(35±15) eV。

2.3溶液的制備

2.3.1三葉苷對照品溶液的配制 精密稱取三葉苷對照品10.30 mg于10 mL棕色量瓶，加甲醇完全溶解并定容，配制成濃度為1.03 mg · mL-1的儲備液。

2.3.2不同pH值緩沖液的配制 根據《中華人民共和國藥典》2015年版8004緩沖液配制方法，分別配制pH值為1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，8.0，9.0，10.5，11.0，12.0的磷酸鹽緩沖液(PBS)，用精密pH計測定，并校正至所需pH值。

2.3.3正辛醇飽和溶液及水飽和正辛醇溶液的配制 精密量取等體積的不同pH值的PBS和正辛醇混合，置于恒溫振蕩器中，在37 ℃下，以100 r·min-1震蕩4 h，靜置分層后取上下層溶液，上層即為水飽和正辛醇溶液，下層為正辛醇飽和PBS溶液。

2.4方法學驗證

2.4.1專屬性驗證 在上述“2.1”項色譜條件下，三葉苷對照品溶液及樣品溶液色譜峰均分離良好，根據三葉苷分子式C21H24O10，相對分子質量436.14，得到離子峰M+H：437.14，提取的離子流圖譜中無雜質干擾，保留時間5.17 min(圖1)。

A.空白溶劑色譜圖；B.三葉苷對照品提取的離子流色譜圖；C.三葉苷對照品質譜圖。

2.4.2線性關系考察 精密吸取三葉苷對照品儲備液，用甲醇稀釋，濃度分別為1030，686.7，515.0，257.5，128.8，64.4，32.2，16.1 ng·mL-1，在本研究檢測條件下測定三葉苷對照品的峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標，濃度為橫坐標(X)進行線性回歸，繪制標準曲線，得線性回歸方程為Y=40.26X+52.31。表明在本研究色譜條件下，三葉苷在16.1～1030 ng·mL-1濃度范圍內，藥物濃度與峰面積線性良好(R2=0.999 5)。

2.4.3精密度實驗 精密吸取三葉苷對照品儲備液，稀釋成高、中、低(686.7，128.8，42.9 ng·mL-1)濃度，分別日內連續進樣3次記錄峰面積，計算測定的濃度和RSD，考察日內精密度；另將上述3個對照品連續進樣3 d，計算測定濃度和RSD，考察日間精密度。結果如表1所示，其日內、日間RSD均在3%以下，表明該方法精密度良好。

表1 三葉苷日內、日間精密度結果

2.4.4穩定性實驗 精密吸取三葉苷儲備液，稀釋成高、中、低3個濃度，分成兩組，分別置于4 ℃和25 ℃條件下避光保存，放置7 d，在第1，3，5，7天取樣，按本研究色譜條件測定得峰面積，通過回歸方程計算其濃度，計算RSD%。

結果顯示(表2)，三葉苷在4 ℃放置1周，其濃度無顯著降低(RSD< 3%)，穩定性好；而三葉苷在25 ℃放置1周后，濃度逐漸降低(RSD> 5%)，表明三葉苷在室溫條件下降解。因此，三葉苷配制成溶液后，應放置于4 ℃環境并避光保存。

表2 三葉苷在4 ℃和25 ℃的穩定性

2.4.5重復性及回收率實驗 精密吸取三葉苷儲備液，稀釋成同一濃度的對照品溶液6份，在本研究色譜條件下進樣檢測，記錄峰面積，計算測定的濃度和RSD，結果測得對照品含量的RSD為0.38%，表明該方法重復性良好。

取已知濃度的三葉苷儲備液3份，分別向其中加入高、中、低濃度的三葉苷對照品溶液，按本研究色譜條件測定峰面積，計算高、中、低濃度的加樣回收率分別為(93.79±0.54)%，(90.62±0.38)%，(87.13±0.74)%，RSD均<5%，表明其回收率符合含量測定要求。

2.5三葉苷平衡溶解度的測定 稱取過量的三葉苷對照品，加入不同pH值的PBS中，制備三葉苷過飽和溶液，置于37 ℃恒溫搖床中，以100 r·min-1振蕩24 h后，將其轉移至離心管，12 000 r·min-1離心15 min(r=7 cm)，取上清液，用甲醇稀釋，經微孔濾膜濾過后，取樣進行UPLC-MS/MS分析，結果pH值1.2，2.0，4.5，6.5，7.5，9.0，10.5，12.0的PBS中三葉苷平衡溶解度分別為0.90，1.16，1.83，2.72，3.91，11.73，15.51，23.79 mg·mL-1。可見，三葉苷的溶解度具有pH值依賴性，隨著pH值的增加而顯著增大。按照2015年版《中華人民共和國藥典》規定，在pH值 1.2的緩沖液中，三葉苷極微溶解；在接近體內腸液pH值的緩沖液(pH值 6.5)中顯示為微溶；當pH值為堿性溶液(pH值 >9.0)時，三葉苷溶解度急劇增大，在pH值 12.0時，其最大溶解度為23.79 mg·mL-1，表明三葉苷為難溶性藥物，其在生理環境中溶解度較差。

另取上清液稀釋，用紫外分光光度計進行吸收波長掃描，考察不同pH值溶液中三葉苷紫外吸收波長的變化(圖2)。

圖2 三葉苷在不同pH值溶液中的紫外吸收光譜

結果顯示，三葉苷的最大吸收波長(220，284 nm)均隨pH值變化發生了偏移，尤其在284 nm處，隨著pH值增大，最大吸收峰波長顯著向長波方向移動，進一步表明三葉苷的溶解度受溶液pH值的顯著影響。

2.6三葉苷表觀油水分配系數的測定 稱取過量的三葉苷對照品加入正辛醇溶液中，飽和至溶液出現淺黃色沉淀，置于37 ℃恒溫振蕩器中振蕩，靜置后3000 r·min-1離心5 min(r=7 cm)，取上清液經孔徑0.45 μm濾膜濾過，濾液稀釋300倍后，取樣品溶液進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，計算三葉苷在正辛醇相中的初始濃度。

精密量取三葉苷飽和的正辛醇溶液加入棕色量瓶中，再分別加入不同pH值的正辛醇飽和PBS溶液，定容。將量瓶置于37 ℃恒溫振蕩器中，振搖6 h后，3000 r·min-1條件下離心5 min(r=7 cm)分層，取下層水溶液，經孔徑0.45 μm濾膜濾過，濾液稀釋100倍，取100 μL樣品溶液進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，計算三葉苷濃度。根據以下公式計算表觀油水分配系數Papp，并求對數值lgP。

Papp為三葉苷的表觀油水分配系數；C0為正辛醇相中三葉苷的初始濃度；V0為水飽和的正辛醇體積；Cw為藥物分配平衡時測得水相中三葉苷的濃度；Vw為水相體積。

結果如圖3所示，三葉苷的表觀油水分配系數lgP值隨溶液pH值上升而減小，在酸性或偏酸性溶液中(pH值=1.2～5.5)，lgP在0.15～0.26之間；pH值=7.5時，其lgP為0.03；pH值>8.5時，lgP<0，表明三葉苷在堿性條件下親水性增加。

圖3 三葉苷的表觀油水分配系數

3 討論

平衡溶解度和油水分配系數是藥物的重要理化參數，二者會直接影響藥物在體內的吸收程度及速度[7]。藥物溶解是其在生物體內吸收的重要前提，溶解度小的藥物常常存在吸收困難的問題，本研究結果顯示，三葉苷在酸性及中性環境中溶解度均極低，在pH值 12.0時，最大溶解度為23.79 mg·mL-1，表明三葉苷為難溶性藥物，其在胃腸道生理環境下溶解性較差，推測其口服吸收效率低。

藥物的結構會直接影響其在不同pH值溶液中的溶解程度，三葉苷含有酚羥基結構，堿性溶液會促進酚羥基解離而增加溶解度。本研究結果表明三葉苷的溶解度隨著pH值升高而顯著增大。紫外分光光度計進行全波長掃描結果進一步顯示，三葉苷的最大吸收波長(284 nm)隨著pH值增加而顯著向長波方向移動，推測三葉苷在堿性溶液中解離程度高于酸性溶液，其溶液中以分子和離子狀態存在的含量不同而導致。

表觀油水分配系數是預測藥物膜滲透能力的重要理化參數，尤其在藥物的腸吸收過程中，要求藥物具有合適的脂溶性和水溶性[8]。lgP值對于胃腸道中藥物的吸收速率有顯著影響，當lgP值>5，藥物脂溶性太強，水溶性低，腸道吸收后難以進入血液或淋巴液中；而lgP值較低(1gP<-2)時，藥物水溶性強，脂溶性低，不能穿過細胞脂質膜而難以吸收；理想的藥物lgP值為-1.0

藥物在有機相和水相中分配過程相當復雜，其在水相中可發生酸式或堿式解離，了解不同pH值條件下的表觀油水分配系數具有重要意義。本研究結果顯示，在pH值梯度變化的PBS溶液中，三葉苷的表觀油水分配系數隨著pH值上升而減小，在酸性或偏酸性條件下lgP>0；在堿性條件下，lgP<0。因此，三葉苷在pH值偏高的腸段可能發生解離，脂溶性減小，導致膜通過效率降低。

在口服吸收過程中，藥物在胃腸道的溶出及腸壁上的通透性至關重要，本研究根據胃腸道pH值的梯度變化，測定了三葉苷在不同 pH值緩沖液的平衡溶解度和油水分配系數，為后續藥物吸收代謝研究以及新制劑、新劑型的研發提供了重要依據。同時，本研究結果表明，三葉苷體內溶解性低，lgP推測其膜通過性較好，因此，需要采用適當的制劑手段改善其體內溶解性，有效提高其口服生物利用度，從而更好地進行藥理、藥效學評價。