小兒宣肺止咳顆粒對大鼠的長期毒性反應*

郟自明，任平遠，葛朝，鄭艷華，樊軍，黎炎梅

[1.湖北省疾病預防控制中心、應用毒理湖北省重點實驗室，武漢 430075；2.健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司，隨州 441300]

小兒宣肺止咳顆粒由麻黃、防風、西南黃芩、桔梗、芥子、苦杏仁、葶藶子、馬蘭、黃芪、山藥、山楂、甘草等12味中藥組成，臨床功效為宣肺解表、清熱化痰，主要用于治療小兒外感咳嗽、痰熱壅肺所致的咳嗽痰多、痰黃 黏稠、咳嗽不爽等癥[1]。現(xiàn)代藥理學表明麻黃、防風、西南黃芩、桔梗有解熱鎮(zhèn)痛的作用；麻黃、甘草、防風、西南黃芩、桔梗、馬蘭能有效抗菌、抗病毒；苦杏仁、山楂有明顯的抑菌作用；麻黃、苦杏仁、甘草、桔梗、白芥子、葶藶子、山楂有鎮(zhèn)咳祛痰的功效；甘草、防風、黃芪、西南黃芩、山楂能調(diào)節(jié)免疫功能[2]，在體外培養(yǎng)細胞及小鼠體內(nèi)對流感病毒株和柯薩奇B6病毒株均有抗病毒作用[3]。根據(jù)臨床觀察結果該藥具有宣肺止咳、清熱化痰的功效，可以用于治療小兒支氣管肺炎，可為臨床用藥提供新的選擇[4]。本產(chǎn)品已在臨床應用，批準文號為(97)衛(wèi)藥準字Z-029號，按照國家食品藥品監(jiān)督管理總局對該產(chǎn)品中藥保護品種審批意見需完善藥理、毒理等基礎研究，因臨床用藥周期以3 d為1個療程，所以本實驗按照《藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范》(國家食品藥品監(jiān)督管理總局2017年9月1日頒布)和《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》(國家食品藥品監(jiān)督管理總局2014年5月頒布)設計大鼠重復經(jīng)口給予小兒宣肺止咳顆粒1個月毒性實驗，觀察大鼠出現(xiàn)的毒性反應，并通過4周的恢復期觀察，評估其所產(chǎn)生不良反應的性質(zhì)和程度，尋找毒性靶器官和長期用藥后可能出現(xiàn)的延遲性毒副反應，以期確定無毒性反應劑量，為擬定人用安全劑量提供參考。

1 材料與方法

1.1藥物、溶媒與實驗動物 小兒宣肺止咳顆粒由健民集團葉開泰國藥(隨州)有限公司提供，批號：160354，溶媒為純化水。選取5～6周齡SPF級SD大鼠，雌雄各60只，雌性體質(zhì)量80.8 ～110.5 g，雄性體質(zhì)量87.1～112.0 g，大鼠體質(zhì)量均未超出平均體質(zhì)量的20%，購于湖北省實驗動物研究中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，實驗動物質(zhì)量合格證號：42000600017879，實驗大鼠飼養(yǎng)于屏障系統(tǒng)，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2012-0065。實驗動物設施使用證明號：00185628。

1.2主要儀器 SYSMEX2000全自動血球計數(shù)儀、CA-510全自動血凝分析儀(均為日本SYSMEX公司)；AU680型全自動生化分析儀(貝克曼庫爾特有限公司)；迪瑞H-800全自動尿液分析儀(長春迪瑞醫(yī)療科技有限公司)；Practum612-1CN動物天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，感量：10 mg]；PL1501-S組織天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司，感量：0.01 mg]；Excelsior ES全自動脫水儀、HistoStar全自動包埋儀、HM340E輪轉(zhuǎn)切片機、Varistain Gemini全自動染色機、ClearVue全自動蓋片機(均為美國Thermo公司)；DM2500光學顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3實驗方法 小兒宣肺止咳顆粒兒童每天最大臨床用量為36.0 g，1 kg小兒宣肺止咳顆粒浸膏相當于2.595 kg成品顆粒，換算成浸膏每日用量為13.87 g。根據(jù)由體表面積公式lgS=0.876 2+0.698 lgW計算大鼠等效劑量(浸膏)為1.47 g·kg-1。根據(jù)廠家提供的資料及本中心前期做的大鼠急性毒性實驗結果顯示該供試品毒性較低，按照《藥物重復給藥毒性試驗技術指導原則》要求大劑量應出現(xiàn)明顯毒性反應或達到最大給藥量，本實驗大劑量采用最大給藥量法，小劑量采用高于大鼠等效劑量的原則進行劑量設計。小兒宣肺止咳顆粒浸膏的最大密度為1.35 g·mL-1，大鼠按15 mL·kg-1灌胃計算得大劑量為20.25 g·kg-1·d-1(相當于臨床劑量的72倍)，小劑量大于大鼠等效劑量為3.00 g ·kg-1·d-1(相當于臨床劑量的11倍)，再設一中劑量為7.80 g ·kg-1·d-1(相當于臨床劑量的28倍)。

大鼠按體質(zhì)量分層隨機分組設計[5]分為4組，即正常對照組和小兒宣肺止咳顆粒小、中、大劑量組(簡稱小、中、大劑量組)。每組大鼠30只，雌雄各15只。每天按15 mL·kg-1灌胃給藥1次，連續(xù)給藥1個月，正常對照組給予等體積的純化水，每周按體質(zhì)量調(diào)整一次給藥量。給藥1個月后各組取20只大鼠(雌雄各半)進行末期檢查，停藥后各組余10只大鼠(雌雄各半)進行4周的恢復期觀察。每日觀察1次大鼠的一般癥狀，包括外觀體征、毛色、行為活動、尿液、糞便性狀；每周檢測1次大鼠體質(zhì)量、進食量；血液學、血液生化學、尿液學、臟器系數(shù)和病理組織學檢查分別在給藥末期和恢復期觀察結束后進行。

2 結果

2.1對大鼠一般狀況的影響 本實驗中未發(fā)生非計劃大鼠死亡，給藥期和恢復期各組大鼠的外觀體征、行為活動、毛色、呼吸及對外界反應均未見明顯異常。

2.2對大鼠體質(zhì)量的影響 雌鼠：大劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8天低于對照組(P<0.01)，給藥第15，22，29天和恢復期與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；小、中劑量組在給藥期和恢復期大鼠體質(zhì)量與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。結果見表1。

表1 4組雌性大鼠在不同時間的體質(zhì)量變化

雄鼠：大劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15，22，29天均低于正常對照組(P<0.01)，恢復期第36天大鼠體質(zhì)量低于正常對照組(P<0.05)，恢復期第43，50，57天大鼠體質(zhì)量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；中劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15天均低于正常對照組(P<0.01)，給藥第22，29天和恢復期與正常對照組差異無統(tǒng)計學意義；小劑量組大鼠體質(zhì)量在給藥第8，15，22天均低于正常對照組(P<0.01，P<0.05)，給藥第29天和恢復期正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。結果見表2。

表2 4組雄性大鼠在不同時間的體質(zhì)量變化

2.3對大鼠攝食量的影響 雌鼠：大劑量組攝食量給藥第1天低于正常對照組(P<0.01)，給藥第29攝食量低于正常對照組(P<0.05)，給藥第8，15，22天和恢復期攝食量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；小劑量組在給藥期和恢復期攝食量與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。見表3。

表3 4組雌性大鼠在不同時間的攝食量變化

雄鼠：大劑量組攝食量在給藥第1，8，22，29天均低于正常對照組(P<0.01，P<0.05)，給藥第15天和恢復期攝食量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；中劑量組在給藥期和恢復期攝食量與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義；小劑量組攝食量在給藥第8天低于正常對照組(P<0.05)，給藥第1，15，22，29天和恢復期攝食量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表4。

表4 4組雄性大鼠在不同時間的攝食量變化

2.4對眼科檢查的影響 4組大鼠眼科檢查雙眼瞳孔反射均正常、眼底檢查均無可見損傷。

2.5對血液學指標的影響 給藥末期雌鼠中、大劑量組白細胞(WBC)均高于正常對照組，嗜酸性粒細胞比率(EOS%)低于正常對照組(P<0.01)，紅細胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)高于正常對照組(P<0.05)；中劑量組大鼠淋巴細胞百分率(LYMP%)高于正常對照組(P<0.05)；小、中、大劑量組大鼠EOS%低于正常對照組(P<0.01)；恢復期中、大劑量組大鼠凝血酶原時間(prothrombin time，PT)低于正常對照組(P<0.05)；其他指標與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。給藥末期雄鼠大劑量組EOS%低于正常對照組(P<0.05)；恢復期中劑量組大鼠WBC、MCHC、血紅蛋白(Hb)低于正常對照組(P<0.05)。其他指標[紅細胞(RBC)、紅細胞比容(HCT)、血小板(PLT)、紅細胞平均體積(MCV)、紅細胞平均血紅蛋白含量(MCH)、中性粒細胞(NEUT)、單核細胞(MONO)、嗜堿性粒細胞(BASO)、網(wǎng)織紅細胞(RET)、活化部分凝血活酶時間(APTT)]與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。見表5，6。

表5 4組雌性大鼠血液學指標的變化

表6 4組雄性大鼠血液學指標的變化

2.6對血液生化學指標的影響 給藥末期雌鼠大劑量組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、總膽紅素(T-BiL)、尿素氮(BUN)均高于正常對照組(P<0.05或P<0.01)，血糖(GLU)、鈉離子(Na+)、氯離子(Cl-)均低于正常對照組(P<0.05，P<0.01)；中劑量組白蛋白(ALB)高于正常對照組(P<0.05)。其他指標與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。給藥末期雄鼠大劑量組ALT、BUN、T-BiL、堿性磷酸酶(ALP)高于正常對照組(P<0.01)，GLU、Na+、Cl-低于正常對照組(P<0.01)；中劑量組大鼠ALP、BUN高于正常對照組(P<0.01)，Cl-低于正常對照組(P<0.05)。其他指標[天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CREA)、總膽固酮(CHOL)、三酰甘油(TG)、肌酸激酶(CK)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(γ-GT)、鉀離子(K+)]與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。見表7，8。

表7 4組雌性大鼠血液生化指標的變化

表8 4組雄性大鼠血液生化指標的變化

2.7對臟器系數(shù)的影響 給藥末期和恢復期小、中、大劑量組大鼠臟器系數(shù)與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。結果見表9，10。

表9 4組雌性大鼠臟器系數(shù)的變化

表10 4組雄性大鼠臟器系數(shù)的變化

2.8對臟器病理組織學的影響 給藥末期大劑量組6只大鼠肝臟內(nèi)少量炎癥細胞浸潤；大劑量組2只大鼠肝臟內(nèi)少量肝細胞灶性壞死，炎癥細胞浸潤。中、小劑量組及恢復期正常對照組各僅1只大鼠肝臟內(nèi)少量炎癥細胞浸潤，應屬于大鼠自發(fā)病理改變，但大劑量組肝臟的病理改變發(fā)生數(shù)較正常對照組有所增加，表明該病理改變可能與供試品有關。停藥4周，該病理改變消失。見圖1。

圖1 4組大鼠的肝臟病理組織學變化(HE，×200)

2.9尿液分析 給藥末期大劑量組大鼠潛血、尿蛋白陽性率均低于正常對照組(P<0.01)；中劑量組潛血陽性率低于正常對照組(P<0.01)；小、中、大劑量組pH值均低于正常對照組(P<0.01)；小、中、大劑量組大鼠尿膽原、尿膽紅素、酮體、白細胞、尿糖、密度等指標與正常對照組比較均差異無統(tǒng)計學意義。結果見表11。

表11 4組大鼠尿液學指標的變化

3 討論

小兒宣肺止咳顆粒由12味中藥組成，按照工藝提取濃縮至浸膏后加入適量的蔗糖粉和糊精混勻制成顆粒。糊精和蔗糖粉均收錄在藥用輔料手冊(原著第4版)[6]，糊精在顆粒制劑中起到黏合劑的作用，蔗糖粉可以增加甜味和黏度，作為輔料應用的劑量下用于口服制劑處方中，基本無毒、無刺激性。小兒宣肺止咳顆粒中浸膏的含量占38.5%，而輔料占61.5%，為了充分觀察受試物在大鼠體內(nèi)最大暴露量的毒性反應情況，所以本實驗采用去除糊精和蔗糖粉等輔料的浸膏作為受試物。

大鼠連續(xù)灌胃給予小兒宣肺止咳顆粒1個月，大劑量組雄性大鼠體質(zhì)量在給藥期至恢復期1周均低于正常對照組，大劑量組大鼠至恢復期結束體質(zhì)量逐步恢復正常；中劑量給藥后2周和小劑量給藥后3周大鼠體質(zhì)量低于正常對照組，之后中、小劑量大鼠體質(zhì)量逐步恢復正常；雌性大鼠僅大劑量組給藥后1周體質(zhì)量低于正常對照組；由此表明本品對大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用，尤以大劑量對體質(zhì)量的影響較大，并且對雄性大鼠的影響較雌性大鼠明顯，恢復4周后大鼠體質(zhì)量可以恢復。大劑量組雄性大鼠攝食量在給藥期低于正常對照組，恢復期恢復正常；小劑量組大鼠僅在給藥后第2周攝食量低于正常對照組，雌性大鼠中、大劑量組僅給藥后第1周和第29天大鼠攝食量低于正常對照組，未呈現(xiàn)規(guī)律性的劑量關系；由此表明本品大劑量對雄性大鼠攝食量有一定的抑制作用，停藥后恢復。通過對本品大劑量對雄性大鼠體質(zhì)量和攝食量的抑制作用分析，其原因可能與雄性大鼠因供試品灌胃濃度和體積較大有關。

大鼠血清生化指標的結果顯示，大劑量組大鼠的ALT、T-BiL、ALP高于正常對照組，GLU低于正常對照組，以上血清生化指標均為反映肝功能的指標，同時病理組織學觀察發(fā)現(xiàn)大劑量會引起部分大鼠肝臟炎癥細胞浸潤和個別大鼠少量肝細胞壞死，恢復期結束時以上指標均恢復正常；中劑量組僅雄性大鼠ALP、雌性大鼠ALB高于正常對照組，但其他反映肝功能的指標未見異常，病理組織學觀察未發(fā)現(xiàn)中劑量組大鼠肝臟出現(xiàn)病理改變，并且這些數(shù)據(jù)處于文獻數(shù)據(jù)[7-9]正常參考值的范圍內(nèi)，所以該兩項指標數(shù)據(jù)在統(tǒng)計學上雖有一定的統(tǒng)計學意義，但無生物學意義；本研究表明小兒宣肺止咳顆粒大劑量可引起肝臟輕度損傷，停藥4周后可恢復正常。中、大劑量組大鼠的BUN高于正常對照組，Na+、Cl-低于正常對照組，但這些數(shù)據(jù)處于本中心大鼠歷史背景數(shù)據(jù)正常血液學參考值和文獻數(shù)據(jù)[7-9]正常血液學參考值的范圍內(nèi)，結合病理組織學觀察未發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟出現(xiàn)病理改變，在本實驗中可判定以上數(shù)據(jù)雖有一定的統(tǒng)計學意義，應無生物學意義。

從實驗結果可知大鼠血清γ-GT測定值水平較低，陳威等[10]報道γ-GT是一種胚胎蛋白，在成年大鼠活性很低，只有在化學致癌劑誘發(fā)肝癌的早期階段其活性才會異常升高，說明在本實驗中大鼠血清的γ-GT活性水平很低，和文獻報道基本一致。

給藥末期中、大劑量組大鼠WBC高于正常對照組，EOS(%)低于正常對照組；恢復期中劑量組大鼠WBC低于正常對照組，中、大劑量組大鼠PT低于正常對照組，以上數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)一定的規(guī)律性，也無一定劑量反應關系，并且這些數(shù)據(jù)均處于文獻數(shù)據(jù)[6-8]正常參考值的范圍內(nèi)，提示在本實驗中可判定以上數(shù)據(jù)雖有一定的統(tǒng)計學意義，但無生物學意義。

給藥末期潛血、尿蛋白陽性率與正常對照組比較有顯著差異，由于該兩項指標陽性率低于低于正常對照組，雖然有一定的統(tǒng)計學意義，但無生物學意義。給藥末期小、中、大劑量組大鼠尿液pH值低于正常對照組，停藥4周后恢復正常，文獻資料[11]顯示大鼠尿液pH正常值參考范圍7.38～8.50，楊趁霞[12]報道影響尿液pH值的因素多是食物酸堿性和所服藥物酸堿性所造成，委托方提供的小兒宣肺止咳顆粒檢測報告顯示樣品pH值為4.44，由此分析小、中、大劑量組大鼠尿液pH值下降的原因可能為供試品呈酸性所致，結合尿液其他指標可判定無生物學意義。

綜上所述，大鼠連續(xù)灌胃給予小兒宣肺止咳顆粒1個月， 7.80 g·kg-1·d-1為安全劑量，根據(jù)體表面積等效劑量換算為臨床劑量的28倍；對大鼠體質(zhì)量有一定的抑制作用，尤以大劑量對體質(zhì)量的影響較大，并且對雄性大鼠的影響較雌性大鼠明顯；大劑量對雄性大鼠攝食量有一定的抑制作用，大劑量可引起肝臟輕度損傷，停藥4周后藥物的毒性反應可逆，亦未見藥物引起的其他延遲性毒性反應。