七氟醚麻醉后老年大鼠認(rèn)知學(xué)習(xí)障礙與海馬KIBRA表達及其介導(dǎo)的AMPA受體膜轉(zhuǎn)運的相關(guān)性

王曉坤

（天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 麻醉科，天津 300000）

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction,POCD） 指術(shù)前無精神障礙的病人，受多種因素的影響麻醉和手術(shù)后可出現(xiàn)大腦功能紊亂導(dǎo)致在術(shù)后發(fā)生的可逆的和波動性的急性精神紊亂綜合癥[1]。POCD是麻醉術(shù)后老年患者常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，是影響治療和預(yù)后的的重要因素，更是增加術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率[2,3]。有研究表明七氟醚為臨床常用吸人麻醉藥，可引起術(shù)后認(rèn)知功能障礙。腎腦表達蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA），廣泛表達于人體的腦組織及腎臟組織，KIBRA基因和蛋白與人類記憶有關(guān)且發(fā)現(xiàn)在健康人記憶相關(guān)腦區(qū)表達較高[4,5]。KIBRA 與樹突和突觸極蛋白存在交互作用[4,6]后兩者在神經(jīng)突觸可塑性、信號傳遞中起重要作用[7]。Corneveaux 等[8]對KIBRA與阿茲海默癥（AD）的關(guān)聯(lián)研究表明，在AD病人主要腦區(qū)KIBRA表達有顯著變化。AMPA 受體（α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸受體，AMPAR）介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)快速興奮性突觸傳遞，其在突觸后膜的動態(tài)表達與長時程增強（long-term potentiation，LTP）、長時程抑制的誘發(fā)和維持有關(guān)，參與調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶活動。AMPAR 突觸后膜缺失，可致突觸損傷和功能障礙，與阿爾茨海默病早期認(rèn)知障礙密切相關(guān)。有研究表明KIBRA通過與其有交互作用的結(jié)合伴侶binding partners 參與調(diào)節(jié)AMPA受體膜的運輸[9,10]。基于KIBRA與AD關(guān)聯(lián)研究以及KIBRA在突觸可塑性等方面起到的重要作用，本實驗探討KIBRA是否在七氟醚吸入麻醉相關(guān)的POCD中是否也起到到重要作用，同時探究這一作用機制是否是通過KIBRA調(diào)節(jié)AMPA受體的跨膜運輸來完成，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供健康雄性Wistar大鼠72只（清潔級實驗動物），16～20月齡，體重500～600g。采用隨機數(shù)字表法分為2組，每組36只大鼠，⑴對照組；⑵七氟醚麻醉4h組（實驗組）。

1.2 麻醉方法

將實驗組小鼠置于透明的不完全封閉的麻醉箱中進行麻醉，用麻醉機向麻醉箱中通入七氟醚。利用麻醉氣體監(jiān)測儀監(jiān)測麻醉箱中的七氟醚含量，氧流量為1L/min。維持七氟醚于1.0最低肺泡有效濃度（minimum alveolar concentration，MAC） 4h。小鼠七氟醚1.0MAC根據(jù)參考文獻，采用2.5%濃度。麻醉箱底部裝有鈉石灰以吸收CO2。對照組：將大鼠置于麻醉箱內(nèi)吸入30%氧氣4h，氧流量1L/min。

1.3 檢測指標(biāo)

2組分別取6只大鼠于術(shù)后1d，3d，7d進行Y迷宮實驗，Y迷宮用醫(yī)用有機板制作，內(nèi)外壁貼黑色膠紙。共三個臂，隨機定義為1臂、2臂、3臂，各臂夾角為120度。將大鼠放在一個臂的末端，記錄10min 內(nèi)動物進入各個臂的順序。記錄自發(fā)交替次數(shù)和進入各臂次數(shù)總和，并計算自發(fā)交替百分比。術(shù)后6h每組各6只大鼠取海馬組織制備標(biāo)本，進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實驗（polymerase chain reaction，PCR），用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測術(shù)后AMPA 受體GluR2亞基mRNA水平的改變。免疫印跡實驗（Western-blot） 檢測，術(shù)后第1d，3d，7d每組各8只大鼠取海馬組織制備標(biāo)本，分別提取總蛋白和膜蛋白，采用Western-blot的方法檢測，檢測KIBRA 和AMPA受體亞單位GluR-2的蛋白表達水平。采用免疫共沉淀法檢測檢測KIBRA與AMPA受體亞單位GluR-2的相互作復(fù)合物的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，重復(fù)測量資料比較采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，組間比較采用成組t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Y迷宮實驗

與對照組（C組） 相比，1.0MAC組（M組） 術(shù)后1～7d 活動能力和自發(fā)交替百分有明顯下降，具有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），見圖1、表1。

表1 2組大鼠術(shù)后1d 3d 7d Y迷宮測試結(jié)果比較

圖1 2組大鼠術(shù)后1d 3d 7d Y迷宮測試結(jié)果比較

2.2 術(shù)后海馬組織AMPA受體GluR2亞基mRNA水平的改變

與對照組相比，七氟醚組大鼠術(shù)后4h海馬組織AMPA 受體GluR2亞基mRNA差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05） 見圖2、表2。

圖2 2組大鼠術(shù)后4h海馬組織AMPA受體GluR2亞基mRNA水平的改變

表2 2組大鼠術(shù)后4h海馬組織AMPA受體GluR2 亞基mRNA水平的改變

2.3 KIBRA活性變化，海馬組織KIBRA蛋白水平表達結(jié)果

與C組相比，1.0MAC組術(shù)后海馬組織KIBRA水平降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 2組大鼠術(shù)后1d 3d 7d海馬組織中KIBRA活性變化

2.4 KIBRA-AMPA受體GluR2亞基共表達情況

采用免疫共沉淀法檢測KIBRA與AMPA受體亞單位GluR-2的相互作用，C組相比，1.0MAC組術(shù)后1d，3d，7d海馬組織KIBRA-AMPA受體GluR2亞基復(fù)合物含量降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 2組大鼠1d 3d 7d海馬組織與GluR2亞基共表達的KIBRA的水平的比較

2.5 AMPA受體GluR2亞基膜運輸?shù)淖兓?/h3>

2組大鼠海馬AMPA受體GluR2亞基總蛋白差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。與對照組相比1.0MAC七氟烷處理組術(shù)后不同時間點海馬組織AMPA 受體GluR2亞基膜蛋白水平均降低（P＜0.05），見圖5、圖6。

圖5 2組大鼠術(shù)后不同時點海馬組織AMPA 受體GluR2 亞基總蛋白結(jié)果比較

圖6 2組大鼠術(shù)后不同時點海馬組織AMPA 受體GluR2亞基膜蛋白結(jié)果比較

3 討論

POCD是麻醉術(shù)后老年患者常見的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，臨床上一般難以準(zhǔn)確預(yù)測和診斷，是影響治療和預(yù)后的的重要因素。其中全身麻醉藥物也是加重認(rèn)知功能損傷的重要因素之一[11,12]。Y迷宮自發(fā)交替反應(yīng)測試可以檢測動物的自發(fā)探索行為，可以用來檢測海馬相關(guān)的短期內(nèi)的記憶能力。本實驗結(jié)果表明七氟醚1.0MAC組術(shù)后幾個時間點測量活動能力和自發(fā)交替百分比有明顯下降，表明1.0MAC七氟酸吸入麻醉引起老年大鼠術(shù)后工作記憶損傷，并且能持續(xù)到術(shù)后7d，提示七氟醚麻醉可誘發(fā)老齡大鼠術(shù)后學(xué)習(xí)和記憶功能損傷。

長時程增強（long-term potentiation，LTP） 是指高頻刺激突觸前傳入纖維所引起的突觸傳遞效能的長時間持續(xù)性增強現(xiàn)象。LTP被認(rèn)為是突觸可塑性的經(jīng)典模式，也是研究學(xué)習(xí)與記憶功能的可靠模型。受體和通道是產(chǎn)LTP的生物學(xué)基礎(chǔ)。在海馬LTP 的發(fā)生機制中谷氨酸受體發(fā)揮著重要作用，AMPA 受體是離子型谷氨酸受體。有AMPA受體運輸與LTP相關(guān)研究表明，突觸后膜AMPA受體數(shù)目的改變（受體運輸）是LTP的一種最主要表達機制[13-15]。腎腦表達蛋白（kidney and brain expressed protein，KIBRA），可以編碼突觸后骨架蛋白，最近的研究結(jié)果表明KIBRA作用于包括細(xì)胞極性，膜/囊泡轉(zhuǎn)運等多個生理過程。KIBRA與樹突和突觸極蛋白存在交互作用[16]后兩者在突觸可塑性信號傳遞和細(xì)胞骨架構(gòu)成中起重要作用。

2組大鼠術(shù)后海馬組織AMPA受體GluR2亞基總蛋白無明顯差異。差異在于膜蛋白水平，與C組相比七氟醚組術(shù)后3個時間點海馬組織AMPA受體GluR2 亞基膜蛋白水平降低（P＜0.05）。綜合以上結(jié)果，表明1.0MAC七氟醚吸入對大鼠海馬組織AMPA 受體轉(zhuǎn)錄和翻譯無影響，但是可以對AMPA受體膜轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響，進而由此誘發(fā)術(shù)后認(rèn)知和學(xué)習(xí)功能損害。實驗結(jié)果還提示實驗組海馬組織內(nèi)的KIBRA表達降低，海馬中KIBRA-AMPA受體GluR2 亞基復(fù)合物含量降低，提示KIBRA與七氟醚麻醉相關(guān)的術(shù)后認(rèn)知功能障礙發(fā)生中起到重要作用，起作用機制可能與KIBRA參與調(diào)節(jié)AMPA受體膜的運輸有關(guān)。