ABO等位基因新變異引起正反定型不符2例

蘇蔓 趙倩 郭霞 王遠花 喬芳 王振雷

ABO血型系統是人類認識最早的血型系統，其在臨床輸血、法醫學鑒定、器官移植等領域均有重要的臨床意義[1]。人類ABO血型系統的抗原多態性較高，除常見的A、B、AB、O 4種血型之外，進一步細分的ABO血型，稱為ABO亞型。ABO亞型在基因上多由一個或幾個堿基突變引起，本實驗室血型血清學檢測ABO正反定型不符標本2例經測序均發現ABO新等位基因，現報道如下。

材料與方法

1 標本 先證者1，男，57歲，因頸椎病入院后血型檢測ABO正反定型不符送本實驗室確認；先證者2，女，26歲，孕39周因剖宮產手術術前備血血型鑒定ABO正反定型不符送本實驗室確認。

2 血清學檢查 血型鑒定按文獻[2]及說明書進行操作，試劑包括單克隆抗-A（上海血液生物醫藥有限公司，批號：20150407）、抗-B標準血清（上海血液生物醫藥有限公司，批號：20150407），抗-H試劑（上海血液生物醫藥有限公司，批號：20150129），抗-A1試劑（上海血液生物醫藥有限公司，批號：20151027），反定型Ac、Bc、Oc（上海血液生物醫藥有限公司，批號：20165311）。

3 基因組DNA提取 采用血液基因組DNA抽提試劑盒（天根生化科技有限公司，批號：O3327）嚴格按產品說明書提取DNA。

4 基因測序 對樣本ABO基因擴增產物直接進行6、7外顯子測序，因測序結果無法區分突變所發生的單鏈，為進一步區分將PCR擴增產物連接載體進行克隆測序，測序服務由天津秀鵬生物技術開發有限公司提供。使用Chromas Version 2.6.5軟件閱讀測序圖譜，并與ABO*A1.01序列比較確定突變位點。

結 果

1 ABO正反定型結果 2個標本的血型血清學檢測結果如表1所示，均表現為正反定型不符。

表1 ABO正反定型鑒定結果

2 樣本測序結果 單鏈測序后結果與ISBT（International Society of Blood Transfusion，國際輸血協會）網站“Names for ABO（ISBT 001）Blood Group Alleles”比對。樣本1單鏈1測序結果與ABO*A1.01序列比對發現第7外顯子c.467C＞T和c.978C＞A共2個突變，其中c.467C＞T為ABO*A1.02和ABO*A1.01的差異堿基，c.978C＞A突變未見有報道；樣本1單鏈2測序結果與ABO*A1.01序列比對發現第7外顯子c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C和c.930G＞A共6個突變，與標準序列比對后判定為等位基因ABO*B.01；樣本2單鏈1測序結果與ABO*A1.01序列比對發現第7外顯子c.523G＞A、c.526C＞G、c.657C＞T、c.703G＞A、c.796C＞A、c.803G＞C、c.889G＞A和c.930G＞A共8個突變，即在ABO*B.01的基礎上發生了c.523G＞A+c.889G＞A雙突變，與ABO*B.01序列相比，單獨的c.523G＞A突變已有報道且被ISBT命名為ABO*BW.14，單獨c.889G＞A突變已被命名為ABO*BW.34，同時具有此雙突變的等位基因尚未見有報道；樣本2單鏈2測序結果與ABO*A1.01序列比對發現6、7外顯子c.261delG、c.297A＞G、c.646T＞A、c.681G＞A、c.771C＞T和c.829G＞A共6個突變，與標準序列比對后判定為等位基因ABO*O.01.02。突變位點及結果判讀如表2所示。

表2 2個樣本單鏈測序結果

樣本1的A基因鏈第7外顯子c.978C＞A突變，樣本2的B基因鏈第7外顯子c.523G＞A、c.889G＞A雙突變，測序峰圖如圖1、圖2所示。

圖1 樣本1的A基因在ABO*A1.02基礎上發現新突變，c.978C＞A

圖2 樣本2的B基因在ABO*B.01的基礎上發現雙突變，c.523G＞A，c.889G＞A

討 論

ABO亞型在臨床上常表現為血型血清學試驗正反定型不符。在亞型血清學鑒定中，為了確定具體的亞型類別，除常規使用抗-A、抗-B以及A、B、O型紅細胞外，還必須引入其它一些試劑如：抗-A1，抗-AB，抗-H，A2細胞等，有時為區分亞型的具體類別還需進行吸收放散試驗證實紅細胞上的抗原以及利用唾液進行血型物質分析等。本研究血清學試驗部分因未進一步試驗區分具體的亞型，故該部分結果僅籠統表述為A亞型或B亞型。同時，樣本1血清學反應格局與B（A）/B相近，需用A2細胞進行進一步區分，如反應為弱凝集則為B（A）/B，如無反應則為A亞B，本研究由于條件所限未得到A2細胞，故未能進行進一步血清學區分，而是直接進行分子生物學測序分析。

ABO基因位于染色體9q34.1-34.2，其基因不是直接翻譯產生ABO抗原，而是編碼特異性糖基轉移酶，催化不同單糖轉移到底物受體H抗原上[3]。ABO基因共有7個外顯子組成，其中6、7外顯子占全部編碼區長度的77%，編碼了91%的糖基轉移酶催化活性區域，故ABO基因的多態性主要取決于6、7外顯子的變化。ABO等位基因變異類型以堿基替換為主，此類替換極少引起酶特異性的改變，而是通常表現為酶活性的下降，造成血型抗原表達減弱從而產生亞型[4，5]。

本文報道的2個案例是以血清學改變為初步印象，測序后均發現未報道的等位基因。樣本1的A基因在ABO*A1.02的基礎上發生了c.978C＞A的突變，導致編碼氨基酸p.Asp326Glu變異，而Asp和Glu均為極性帶負電荷氨基酸（酸性氨基酸），但等電點（pI）略有差異，是否由酸性更強的Asp（pI=2.77）突變為酸性較弱的Glu（pI=3.22）影響了酶的構象從而造成酶活性的降低，導致對應抗原表達減弱，尚待進一步研究證實。樣本2測序后發現其B基因在ABO*B.01基礎上發生了c.523G＞A和c.889G＞A聯合突變。在ABO*B.01基礎上單獨c.523G＞A和c.889G＞A的突變對應的基因均已被命名，分別為ABO*BW.14和ABO*BW.34，而本研究樣本2中發現該2個位點的聯合突變尚未見有報道，且血清學試驗結果表現為B抗原減弱，推測為Bw亞型新等位基因。Bw亞型抗原減弱的原因可能是一種或多種機制并存[6]。本研究樣本2中B基因的雙突變中單獨任意一個突變均可造成抗原表達減弱（對應等位基因已被命名），但具體機制仍不清楚。有研究表明，176位p.Arg176Gly為N-乙酰半乳糖胺轉移酶（GTA）和D-半乳糖基轉移酶（GTB）差異蛋白之一，且位于活性位點（21個氨基酸的無序環）之前，176位由Arg突變為Gly后，GTA的催化常數增加且特異性增強[4]。樣本2中B基因的雙突變中的c.523G＞A突變導致緊鄰176位的175位發生p.Val175Met變化，該變化是影響了176位的Gly參與的酶構象，還是175位的氨基酸變化直接影響了酶的活性導致抗原減弱，還需進一步研究確認。同時，樣本2中發現的雙突變現象在ABO亞型基因中非常常見，如在ABO*01.01基礎上c.721C＞T突變為ABO*AW.04，c.523G＞A聯合c.721C＞T突變被命名為等位基因ABO*AW.11；c.467C＞T是ABO*01.02和ABO*01.01的差異堿基，c.467C＞T聯合c.721C＞T突變被命名為等位基因ABO*AW.43。此類雙突變可能是含有不同突變位點高度同源的2個基因發生交換重組產生的。在對抗原表達的影響上，雙突變導致的氨基酸的同時變化是否對抗原減弱有疊加效應，也需進一步研究確認。

值得關注的是很多報道中的堿基突變為同義突變，并未造成編碼氨基酸的改變，但卻引起了血清表現型的改變，可能是雖為同義密碼子，但其使用頻率卻是不相等的，此現象被稱為密碼子的偏好性。研究發現，密碼子的使用偏好性影響RNA加工、蛋白質翻譯、折疊等多個過程，對基因的表達和產物功能有重要意義，可能上述原因為某些報道中同義突變導致血清學改變的因素之一[7，8]。同時，也有相當多的ABO亞型的整個外顯子核苷酸序列均正常，抗原的表達異常可能與ABO基因內含子堿基突變或外顯子的剪切部位以及基因啟動子、增強子堿基突變有關[9]。

ABO亞型的命名是以血清學為基礎的，ABO亞型應有明確的血清學特點，而那些雖然有堿基改變，但并不影響血清學特點的ABO血型不能稱為亞型[9]。本研究在發現血清學變化的基礎上，對樣本ABO基因6、7外顯子擴增后測序，發現了基因突變，推測為該突變引起基因表達產物活性的改變從而導致血清學結果的變化，可以判定為造成ABO亞型表現的新等位基因，下一步擬向ISBT進行申報確認。

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