兩例云南少數民族罕見FUT1基因位點突變致類孟買血型血清學與分子特征分析

羅梓瑜 李春偉 董偉群

類孟買血型屬于H血型系統，H抗原缺乏表現型是指紅細胞上完全或部分缺乏H抗原的稀有表現型。其中，H缺乏的非分泌型被稱為孟買型，其個體紅細胞和分泌液中均檢測不到ABH抗原，而H缺乏和H部分缺乏的分泌型被稱為類孟買型，紅細胞表面缺乏ABH抗原，而在唾液等分泌液中卻可以找到ABH血型物質。類孟買型在中國人群中鮮有報道，有資料表明中國臺灣類孟買血型的比例大約在1/8 000～1/10 000，中國香港約1/15 620[1，2]。在1994年首次報道了3個無效的FUT1等位基因[5]，隨后針對類孟買血型的FUT1（H）和FUT2（Se）基因型的研究報道逐漸深入。迄今為止，世界上大約報道了有60多種FUT1基因突變類型[6]。云南省地處少數民族大雜居的自然地理位置，并且由于本族內通婚現象普遍，因此對于少數民族血型相關基因多態性的研究是保障本地區輸血安全的一項重要任務。我們對2019～2020年本院收集到的2例類孟買血型標本進行了較全面研究。

材料與方法

1 研究對象 患者1：云南少數民族地區傈僳族女姓，28歲，G3P0，現孕39+2W，在縣級醫院產檢時發現血型鑒定正反定型不符，患者否認手術史、輸血史，遂轉至我院就診。患者2：云南少數民族地區傈僳族女性，30歲，常規體檢發現血型鑒定正反定型不符，否認手術史、輸血史。分別取外周靜脈血進行實驗。均簽署知情同意書。

2 試劑儀器 抗-A、抗-B、抗-H（上海血液）；抗-Lea和抗-Leb（Sanquin）；ABO標準紅細胞、抗篩細胞（上海血液）；譜細胞（Sanquin）；核酸提取試劑盒、人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒、FUT1.2外顯子測序試劑盒（江蘇中濟萬泰）；人源抗-A、抗-B（本室自制，效價不低于128，且不含冷凝集素和不規則抗體），所有試劑均在效期內使用。血清學專用離心機（日本久保田，KA-2200）。

3 血型血清學實驗（1）試管法鑒定ABO 及Lewis血型，反定型加自身對照。（2）采用試管法進行抗體篩選和抗體鑒定實驗。（3）與抗-H反應。（4）進行患者紅細胞的吸收放散試驗。

4 基因組DNA提取 按照江蘇中濟萬泰核酸提取試劑盒說明書操作提取基因組DNA，調整其濃度為50 ng/μL，純度A260/A280在1.7～1.8之間的DNA標本進行檢測。

5 ABO血型基因分型 采用江蘇中濟萬泰生物公司人紅細胞ABO血型基因分型試劑盒（熒光PCR法）進行檢測，實驗操作步驟和結果判斷標準按照試劑盒說明書進行，檢測位點包括A，A205，B，O（261G缺失），O1，O2等位基因。

6FUT1、FUT2基因測序 采用江蘇中濟萬泰生物公司FUT1、2外顯子測序試劑盒進行檢測。對FUT1基因第4外顯子和FUT2基因第2外顯子進行擴增，PCR反應體系如下：加入配置好的PCR工作液35 μL與樣本DNA 3.5 μL（濃度50 ng/μL）混合，漩渦混勻工作液-DNA混合液，800 r/min瞬時離心10秒，使館壁殘留液體聚于管底。剪切前期稀釋后的引物反應管，分別向每個引物管中各加入35 μL的上述混合液，蓋上反應管的蓋子。將反應管漩渦混勻，反應管板式離心7 500 r/min 1分鐘。PCR擴增條件為：96℃ 2 min，1 cycle;96℃ 20 s/68℃ 60 s，5 cycle;96℃ 20s/65℃ 50 s/72℃45 s，10 cycle;96℃ 20 s/62℃ 50 s/72℃ 1 min，22 cycle;72℃ 2 min，1 cycle，反應體積設定為40 μL。PCR產物經膠回收純化后進行Sanger測序，測序引物同擴增引物。用Chromas軟件閱讀測序圖譜，使用DAN-MAN5.22軟件將測定所得序列與GENEBANK序號為M35531（FUT1）、U17894（FUT2）的標準序列做比對分析。

結 果

1 血型血清學試驗結果（1）ABO、Lewis血型鑒定與抗-H反應結果見表1。（2）試管法抗體篩選實驗均為陽性，凝集程度無差異。（3）試管法抗體鑒定實驗，血清與譜細胞反應均為陽性且凝集強度無差異，疑為某種高頻抗原抗體。（4）紅細胞吸收放散試驗，放散液與B細胞均呈1+陽性反應，表明兩名患者紅細胞表面均存在較弱的B抗原。根據血清學實驗結果，兩樣本疑為Bmh血型。見表1、表2。

表1 2例類孟買血型的血清學及分子生物學研究結果

表2 抗體鑒定實驗結果

2 ABO 基因分型結果1號患者和2號患者的ABO基因型一致，均為B/B，結果見圖1。

圖1 ABO基因分型結果

3FUT1和FUT2基因測序結果FUT1基因直接測序結果表明，患者①和患者②的FUT1基因均攜帶c.803G＞A純合突變（圖2）。兩例患者的FUT2基因均同時攜帶c.357C＞A和c.385A＞T純合突變（圖3）。

圖2 FUT1基因測序結果

圖3 FUT2基因測序結果

討 論

1952年BHENDE在印度孟買首先發現孟買型，后來LEVINE又在1961年發現類孟買型，孟買型和類孟買型是均為罕見的紅細胞血型，屬于非常重要的Hh血型系統，該系統只有一個H抗原。H抗原的合成是由α（1，2）巖藻糖基轉移酶催化，由GDP-L-半乳糖提供糖基到前體分子末端半乳糖基的C-2位上形成。H抗原在紅細胞上的表達受控于FUT1基因，該基因共有4個外顯子但只有第4外顯子具有編碼功能，故進行分子生物學檢測時，通常只檢測第4外顯子。H抗原缺乏表現型的形成機制是FUT1基因突變導致α1，2-L-巖藻糖基轉移酶失去活性，無法催化L-巖藻糖連接到前體糖鏈上形成H抗原[6]。FUT1座位上的隱性基因h有很多種類型，最常見的是：c.551_552delAG、c.881_882delTT、c.658 C＞T等[1，2]。多數H缺失型紅細胞為某一種突變的純合子，也有一些為兩種不同突變的雜合狀態[8]。在郭忠慧[8]等報道的10例類孟買血型個體中就發現h1h1、h2h2以及h3h3純合的個體，也有h1h2這類雜合個體的出現。

H抗原的合成受FUT1和FUT2兩個同源性較高的基因控制，兩個結構基因都位于19號染色體，是緊密連鎖的兩個位點。兩個基因都編碼α（1，2）巖藻糖基轉移酶，只是編碼的糖基轉移酶分別作用于不同的底物，最終使得FUT1基因決定紅細胞膜上H抗原的表達，而FUT2作為分泌基因，決定了分泌物中是否存在ABH血型物質，并且在紅系中不表達，主要在唾液腺和泌尿生殖組織中表達[8，10]。FUT2（SE）基因包含2個外顯子，所有的蛋白編碼序列都在第2外顯子[11]，因此FUT2基因第2外顯子的分子生物學研究是分析類孟買型個體分泌狀態的關鍵部分。

在血清學實驗的基礎上，通過對FUT1和FUT2基因的分子生物學研究，就能對孟買型和類孟買型的有較為明確的結論。本文報道的兩個病例，來自同一地區的同一少數民族，兩例患者無明確親緣關系但卻存在相同的FUT1和FUT2基因位點的突變，其中FUT1基因c.803G＞A純合突變，導致第268位氨基酸由半胱氨酸（Cys）變為酪氨酸（Tyr），該突變導致α1，2-L-巖藻糖基轉移酶活性改變，進而造成H抗原無法正常合成。在血清學水平，僅能通過吸收放散實驗來檢測紅細胞表面微弱的抗原表達，但在基因分型時可檢測出正常的B基因，該現象符合類孟買血型特征。此外，由于收集的樣本例數較少，尚不能明確c.803G>A是否為該地區少數民族常見突變類型。今后將進一步加大對該地區少數民族樣本的采集檢測，以了解該地區H抗原缺乏型血型頻率以及突變類型。

對FUT2（SE）的研究顯示，兩例傈僳族患者都具c.357C＞T同義突變。在蘇宇清等[13]的報道中所有被研究的41例中國漢族人群均攜帶c.357C＞T同義突變，說明c.357C＞T可能是中國人常見的點突變。此次在傈僳族病例中同樣被檢出，這可作為中國多民族FUT2基因主要流行基因型研究資料之一。c.385A＞T是一個弱的分泌型基因，該位點的錯義突變導致p.Ile129Phe。本文中的兩例患者同時具有c.357C＞T和c.385A>T的Se等位基因突變類型被稱為Sew。有研究表明，這種弱的分泌型等位基因Sew是形成Le（a+b+）的原因[8]，這點與Lewis血型血清學試驗結果一致。并且這種弱分泌狀態的基因型，在蒙古族中報道比例高達25%[12]，這種等位基因Sew在少數民族人群中如此高比例的報道，為中國少數民族H血型基因多態性的研究奠定了基礎。

本研究因條件限制，未能收集先證者的唾液的進行唾液凝集抑制實驗，檢測唾液中的ABH物質，以此來對其分泌狀態進行更全面的了解。此外對兩者家系資料的收集正在積極進行中，對先證者家庭成員相關基因的研究，有助于更全面的了解該地區傈僳族FUT1和FUT2基因的分子基礎、遺傳異質性和基因多態性，以及進一步對FUT1和FUT2基因在少數民族中的連鎖遺傳關系進行全面的研究。

與孟買型不同的是，類孟買血型的個體屬于分泌型的個體，因此血清和分泌液中均存在血型物質，其血清中通常存在不規則抗體，因此類孟買血型的個體在需要輸血時，應當首選自體輸血或同型H抗原缺乏的血液。在自體輸血困難和找不到同型血液時，可謹慎選擇37度時與患者血清無反應或反應最弱的ABO同型血液輸注[15]。

有報道顯示，類孟買血型在不同種族、地域、人群中的分布以及遺傳具有不同的特點。云南拉祜族人群中類孟買血型個體頻率可達1.88%[14]，關于傈僳族類孟買個體的研究未見相關報道，對傈僳族人群類孟買血型進行更進一步的系統性研究，可以對云南少數民族類孟買血型的分布情況以及分子生物學特征有更全面的了解，為云南這個多民族聚集地區的輸血安全工作的開展提供理論基礎，在少數民族血型相關基因的多態性研究過程中具有重要的意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突