兩例B（A）血型的檢測及鑒定*

趙陽 胡曉玉 呂蓉 於娟 王超

ABO血型鑒定在臨床輸血、移植配型、新生兒溶血病檢測等方面有著重要的意義。臨床醫(yī)院在進行ABO血型鑒定時，常常會檢測出正反定型不符的樣本，如亞型樣本，甚至是一些較罕見的亞型樣本，為臨床輸血及治療帶來一些困難。本文中鑒定的B（A）血型就是一種罕見的亞型，在我國的健康人群中B（A）型存在的概率約為8.3/10萬[1]，探討該類血型的鑒定方法以及對該類患者的臨床用血指導(dǎo)均有著重要的意義。

材料與方法

1 樣本來源 樣本1：孕婦（39+4周），女，28歲，前往安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院就診，擬行剖宮產(chǎn)手術(shù)。既往2017年剖宮產(chǎn)一次，無輸血史，無移植史。該院輸血科在對該孕婦血液樣本進行術(shù)前常規(guī)ABO血型鑒定時發(fā)現(xiàn)正反定不符，正定為AB型，反定為B型。樣本2：男，31歲，膝關(guān)節(jié)前十字韌帶完全斷裂，于合肥市第二人民醫(yī)院住院治療，無輸血史，無移植配型史，術(shù)前常規(guī)ABO血型鑒定時發(fā)現(xiàn)正反定不符，正定為AB型，反定為B型。為確定該兩例患者ABO血型，送檢抗凝血和不抗凝血各5 mL至本室進行疑難血型鑒定。

2 試劑與儀器

2.1 儀器：離心機（日本久保田）；全自動磁珠提取純化系統(tǒng)（Thermo）；電泳儀（北京六一）；全自動凝膠成像系統(tǒng)（SYNGENE）。

2.2 試劑：抗-A/抗-B（批號：201900712，上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；反定型A1細胞、反定型B細胞、反定型O細胞（批號：8000262295，8000262295，8000262300，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam公司）；抗-AB（批號：462000，DIAGAST）；抗-H（批號：K1327，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam）抗-A1（批號：K1328，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam）；A2細胞（批號：800045081，Sanquin Plesmanlaan Amsterdam公司）；磁珠法血液DNA提取試劑盒（批號：MD5111-02，Magen）；人類紅細胞ABO血型-CisAB，B（A）基因分型試劑盒（PCR-SSP法）檢測試劑盒（批號：K201902004，天津市秀鵬生物技術(shù)有限公司）；瓊脂糖凝膠（批號：111860，BIOWESTE）。

3 方法

3.1 血型血清學(xué)檢測：按《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第4版）的操作方法進行試管法ABO血型正反定型以及抗-AB、抗-H、抗-A1、A2細胞的試管法凝集實驗，于肉眼及顯微鏡下觀察結(jié)果，并參照血型血清學(xué)診斷標準對檢測結(jié)果進行判定。

3.2 分子生物學(xué)檢測

3.2.1 DNA提取：抗凝血樣采用磁珠法提取DNA，按照DNA提取試劑盒說明書和全自動磁珠提取純化系統(tǒng)要求操作。檢測DNA濃度為30～50 ng/mL，A260/A280值為1.6～2.0，DNA凍存于–20℃?zhèn)溆谩?/p>

3.2.2 PCR-SSP方法檢測：按照試劑說明書要求配制試劑，將混合液和20 μL DNA加入引物板中，混勻后加一滴石蠟油。根據(jù)說明書設(shè)置PCR擴增參數(shù)，將引物板覆膜后置于PCR儀進行擴增。按照試劑說明書中引物孔位圖順序，取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL上樣到瓊脂糖凝膠中，150 V電泳15 min，紫外凝膠成像系統(tǒng)下拍攝成像，依據(jù)說明書進行實驗結(jié)果判讀。

3.2.3 ABO全基因組測序：委托天津市秀鵬生物技術(shù)有限公司對樣本1的ABO基因1-7外顯子進行測序。

結(jié) 果

1 血型血清學(xué)檢測結(jié)果 送檢樣本的血清學(xué)檢測結(jié)果顯示正定型是AB型，反定型是B型，正反定型不符（表1），該反應(yīng)格局符合B（A）血型血清學(xué)格局。

表1 2例樣本的血型血清學(xué)檢測結(jié)果

2 分子生物學(xué)檢測結(jié)果 根據(jù)PCR-SSP試劑說明書的結(jié)果分型表判定，在第1B、2D、2F泳道[B（A）02型特征帶]均出現(xiàn)目的條帶，2G泳道[O1型特征帶]出現(xiàn)目的條帶，其余泳道均為陰性，判定樣本1和2的表型均為B（A）02/O1（圖1）。

圖1 樣本ABO基因PCR-SSP分型結(jié)果

3 基因測序結(jié)果（樣本1）Exon 1、Exon 2、Exon 3、Exon 4和Exon 5測序均沒有發(fā)現(xiàn)突變。Exon 6測序發(fā)現(xiàn)等位基因261出現(xiàn)堿基缺失雜合（圖2），297A＞G雜合（圖3）。Exon 7測序發(fā)現(xiàn)526C＞G、657C＞T、700C＞G、703G＞A、796C＞A、803G＞C和930G＞A雜合（圖5～圖9）。根據(jù)ISBT網(wǎng)站提供的Names for ABO（ISBT 001）blood group alleles v1.1 171023數(shù)據(jù)庫，綜合結(jié)果判定（以A101為參考序列）ABO*B（A）.02/O.01.01基因型。

圖2 標本第6外顯子c.261delG堿基缺失

圖3 標本第 6外顯子c.297A＞G雜合

圖4 標本第7外顯子c.526C＞G雜合

圖5 標本第7外顯子c.657C＞T雜合

圖6 標本第7外顯子c.700C＞G；c.703G＞A雜合

圖7 標本第7外顯子c.796C＞A；c.803G＞C雜合

圖8 標本第7外顯子c.930G＞A雜合

討 論

ABO血型系統(tǒng)最早于1990年提出，至今在臨床輸血和器官移植等方面仍然有重要的意義。對臨床患者和無償獻血者的ABO血型檢測中常會發(fā)現(xiàn)ABO亞型，導(dǎo)致正反定型不一致。ABO亞型是指除了A型、B型、AB型和O型四種主要的表現(xiàn)型以外，人群中還有一部分AB血型的變異型。本文中探討的B（A）血型在我國獻血人群中的檢出率約為1/（5～10）萬，高于歐洲人種的1/（17～58）萬[2]。2015年5月，人類血型基因突變庫（BGMUT）已報道的B（A）等位基因有6種，其中B（A）02、B（A）04、B（A）05和B（A）06均首先在國內(nèi)發(fā)現(xiàn)，以B（A）02和B（A）04等位基因頻率最高[3]。B（A）04等位基因在上海地區(qū)獻血人群中出現(xiàn)的頻率約為1.6/10萬，B（A）02等位基因約為0.78/10萬[4]。在安徽地區(qū)曾有過2例B（A）04型的報道，本文中2例均為B（A）02型，為安徽地區(qū)首次報道，推測安徽地區(qū)人群中B（A）亞型也可能以B（A）04和B（A）02等位基因為主。B（A）表型是常染色體顯性表型，其特征是B型紅細胞上表達弱的A抗原[5]。B（A）型的形成機制是在正常B等位基因序列的基礎(chǔ)上發(fā)生單或多堿基突變，變異的等位基因具有編碼雙功能活性酶的能力，所以血清學(xué)除了表現(xiàn)B抗原特異性，還表現(xiàn)少量A抗原特異性[6]。

B（A）血型血清學(xué)結(jié)果易誤判為A亞B型[7]。本組病例正定型表現(xiàn)為抗A凝集強度為2+較弱，觀察結(jié)果時易將凝集塊搖散，抗B的凝集強度為4+，反定型A1細胞凝集強度為4+或較弱的凝集強度，B細胞和O細胞均不凝集，進一步應(yīng)用抗-AB、抗-H、抗-A1、A2細胞等其他試劑進行血清學(xué)試驗，紅細胞與抗AB反應(yīng)凝集強度為4+，與抗H反應(yīng)凝集強度為4+，H抗原的含量較正常的B細胞強，與抗A1反應(yīng)不凝集，血清與A2細胞反應(yīng)凝集強度為1+或更弱的凝集，符合B（A）血型血清學(xué)格局[8，9]。

為進一步確定樣本的ABO血型，PCR-SSP檢測結(jié)果可判定為B（A）02/O1型。從測序結(jié)果來看1-5外顯子堿基沒有突變，第6號外顯子261位堿基缺失雜合，297位堿基雜合，第7號外顯子657、700、703、796、803和930G雜合，可推斷有ABO*O.01.01和ABO*B（A）.02等位基因。與ABO*B.01相比，ABO*B（A）.02第7外顯子上700位堿基發(fā)生了C＞G的突變，引起234位點脯氨酸突變成丙氨酸，導(dǎo)致266位甲硫氨酸和268位丙氨酸的空間構(gòu)象發(fā)生變化，使糖基轉(zhuǎn)移酶特性發(fā)生改變[10]。測序結(jié)果與本文中SSP的實驗結(jié)果是一致的。

由于B（A）血型的患者容易誤判為AB型，如輸注AB型血液容易引起嚴重的輸血反應(yīng)。理論上B（A）血型患者輸注同型血液或自身輸血最為安全有效，但由于 B（A）型的罕見，B（A）血型在我國獻血人群中的發(fā)生概率可能是1/50 000～1/100 000[11]，因此該血型患者在臨床輸血工作中很難實現(xiàn)同型血液輸注。B（A）型患者的輸血適用于ABO亞型輸血通則，可以輸注O型洗滌紅細胞、AB型血漿和AB型血小板。既往認為最好輸注O型洗滌紅細胞，但在血清學(xué)試驗中發(fā)現(xiàn)B（A）患者紅細胞上的A抗原只與含 MH04的單克隆抗-A有凝集反應(yīng)，而與人源抗-A并無反應(yīng)，同時獻血者血清中抗-B效價多在16～32，從體外血清學(xué)試驗的結(jié)果來看，如果B型獻血者血漿中的抗-A效價不是很高，B（A）血型患者與B型獻血者交叉配血均是相合的，在血液緊缺或需緊急輸血的情況下，可以考慮輸注B型洗滌紅細胞[6]。但配血相合的B型血漿是否會在患者體內(nèi)破壞紅細胞還有待進一步的研究。

血清學(xué)的方法在亞型的鑒定上還存在一定的局限性，單純依靠血型血清學(xué)無法準確鑒定B（A）血型，采用血型血清學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法進行鑒定，能夠提高鑒定準確率，可以較好的解決臨床輸血問題。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。