碳青霉烯酶耐藥肺炎克雷伯菌耐藥基因分布及與表型相關性分析

謝強 謝瑞玉 徐添天

隨著抗菌藥物的大量及不合理使用，多重耐藥和泛耐藥菌在臨床上不斷出現，嚴重威脅人類健康。耐碳青霉烯酶類抗菌藥物的腸桿菌目細菌，特別是耐碳青霉烯類抗菌藥物的肺炎克雷伯菌（CRKP）危害尤為嚴重[1]，全國細菌耐藥監測網的數據顯示，亞胺培南耐藥率從2014年的4.8%升至2019年的10.5%[2]。由于CRKP的高傳播力和高耐藥率以及CRKP感染者的高死亡率，CRKP引起臨床廣泛關注[3，4]。近年來，我院肺炎克雷伯菌對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥率呈上升趨勢[5]。因此，研究我院CRKP的耐藥機制，對遏制我院CRKP的流行和傳播有重要意義。本研究以全基因組測序技術全面研究本院分離的CRKP的耐藥基因分布，探討其與耐藥表型的相關性，現報道如下：

材料與方法

1 菌株來源 收集我院2020年1月～2020年11月分離的臨床非重復CRKP 28株。其中26株來自呼吸道標本，2株來自血液標本。

2 主要儀器與試劑 全自動微生物鑒定儀VITEK-2 Compact及AST-N334藥敏卡購自法國梅里埃公司；Heal Force A2型生物安全柜購自力康國際貿易（上海）有限公司；SHP-400E型智能生化培養箱購自上海三發科學儀器有限公司；臺式高速離心機、微量移液器購自德國Eppendorf公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購于天根生華科技（北京）有限公司；血平板、麥康凱平板和MH平板均購自鄭州安圖有限公司；藥敏紙片購自英國Oxoid公司。

3 細菌鑒定和藥敏試驗 采用VITEK-2 Compact全自動微生物分析系統，部分藥物補充試驗采用紙片擴散法（K-B法），具體標準參照CLIS 2019[6]推薦的方法。

4 全基因序列測定 用天根生華科技（北京）有限公司的細菌基因組DNA提取試劑盒提取待測細菌基因組。將所提基因組DNA送至北京諾和致源科技股份有限公司測序，高通量測序（Illumina NovaSeq PE150測序平臺）得到的原始圖像數據文件經CASAVA堿基識別（Base Calling）分析轉化為原始測序序列（Sequenced Reads），即Raw Data或Raw Reads，結果以FASTQ（簡稱為fq）文件格式存儲，其中包含測序序列（reads）的序列信息以及其對應的測序質量信息。對測序數據進行過濾處理，去除包含Adapter的序列及低質量數據，得到的Clean Data用于后續分析。

5 耐藥基因分析 使用CARD數據庫（Comprehensive Antibiotic Research Database），該數據庫是近年來最受關注的抗性基因數據庫，它具有信息全面，對用戶友好，更新維護及時等優勢。該數據庫的核心構成是Antibiotic Resistance Ontolog（ARO），它整合了序列、抗生素抗性、作用機制、ARO之間的關聯等信息，通過該數據庫的注釋，可以找到耐藥性相關基因的名稱，所耐藥的抗生素種類等信息。使用CARD數據庫提供的Resistance Gene Identifier（RGI）軟件將目標物種的氨基酸序列與CARD數據庫進行比對（RGI內置blastp，默認evalue≤1e-30），根據RGI的比對結果，統計注釋到數據庫的抗性基因信息，最終得到28株CRKP攜帶的所有耐藥基因。

6 耐藥表型與耐藥基因型的符合率 根據藥物敏感試驗的耐藥表型與WGS檢測篩查出的耐藥基因型一致者，定義為兩者符合；否則，均視為不符合。

結 果

1 28株CRKP耐藥基因檢測結果 28株CRKP經全基因組測序檢測，共發現47種耐藥基因。28株CRKP均攜帶1種碳青霉烯類耐藥基因，其中25株攜帶blaKPC-2基因，2株攜帶blaNDM-5基因，1株攜帶blaOXA-48基因；28株CRKP均攜帶ESBLs耐藥基因，其中以blaTEM-1和blaCTX-M-15最多，分別檢出25株和21株；氨基糖苷類耐藥基因中，AAC（6'）-Ib-cr和AAC（3）-IIa檢出最多，分別檢出20株和19株，其中18株同時攜帶兩者；喹諾酮類耐藥基因中，oqxA和AAC（6'）-Ib-cr檢出最多，分別檢出24株和20株，其中20株同時攜帶兩者；28株CRKP均檢出磷霉素耐藥基因FosA6；磺胺類耐藥基因有3種，其中sul2有6株CRKP攜帶。28株CRKP除均攜帶碳青霉烯類耐藥基因外，還同時攜帶不同型別的ESBLs耐藥基因、磷霉素耐藥基因FosA6。其中，27株（96.43%）還同時攜帶氨基糖苷類耐藥基因和喹諾酮類耐藥基因。具體的耐藥基因檢出情況見表1，部分菌株DNA序列組裝結果的Scaffold文件見圖1。

圖1 部分菌株DNA序列組裝結果的Scaffold文件

表1 28株CRKP攜帶常見的耐藥基因型

2 耐藥表型與耐藥基因型符合率 28株CRKP的耐藥表型與耐藥基因型符合率結果：碳青霉烯類、頭孢菌素和阿米卡星的符合率均為100%，喹諾酮類和慶大霉素的符合率均為96.43%，磺胺類的符合率為87.50%。具體見表2。

表2 28株CRKP耐藥基因與耐藥表型符合率的比較

討 論

本研究分離的CRKP主要來自于呼吸道標本，占92.86%，提示呼吸道感染應為CRKP感染的防控重點[7]。且28株CRKP對碳青霉烯類、頭孢菌素類、β-內酰胺類/β-內酰胺酶抑制劑合劑的耐藥率為100%，對阿米卡星的耐藥率14.29%，未檢出替加環素耐藥株。產生碳青霉烯酶是CRKP對碳青霉烯類藥物耐藥最主要的機制[8，9]。通過全基因測序結果顯示，28株CRKP中25株產blaKPC-2酶，2株產blaNMD-5酶，1株產blaOXA-48酶，這與王方等研究相似[10]。本研究檢出的β-內酰胺酶較多，主要有blaKPC-2、blaNDM-5、blaOXA-48、blaOXA-33、blaCTX-M-15、blaSHV-28、blaTEM-1，其中blaSHV（blaSHV-11、blaSHV-27和blaSHV-28）和blaCTX-M（blaCTX-M-15、blaCTX-M-99 和blaCTX-M-3）的檢出率分別為100%和92.86%，高于楊燕文等報道[11]。磺胺類的耐藥基因（sul1、sul2和sul3）檢出率為25.00%，低于有關研究[12]，甲氧芐氨嘧啶耐藥基因（dfrA14和dfrA12）的檢出率為21.43%，這與復方新諾明的藥敏結果不一致，可能存在其他耐藥基因，比如整合子介導的耐藥等；27株CRKP檢出喹諾酮類耐藥基因，低于左氧氟沙星的藥敏（耐藥率100%）結果，可能與其他抗菌藥物的耐藥基因的高表達起協同耐藥的作用或者是固有基因的突變引起；檢出眾多氨基糖苷類耐藥基因，由測序結果可以看出，rmtB基因可能是阿米卡星的主要耐藥基因，因為4株耐藥株中均檢出了rmtB基因。國內外研究顯示[13，14]，磷霉素是目前多重耐藥細菌治療常用藥物。據文獻報道，產ESBLs的大腸埃希菌對磷霉素的敏感率高達86%～100%[15]。ANDREA ENDIMIANI等[16]的研究結果顯示，68株攜帶有blaKPC耐藥基因的肺炎克雷伯菌，其中包括23株對替加環素和/或多粘菌素不敏感的菌株，對磷霉素的敏感率為87%～93%。本研究中，未對磷霉素進行藥敏實驗，但從全基因測序的結果中發現，28株CRKP均攜帶磷霉素耐藥基因FosA6，磷霉素對本院CRKP感染的治療可能均無效，這與丁月平等[17]的研究結果相同。本研究未檢出四環素類抗菌藥物的耐藥基因，藥敏結果顯示，1株CRKP對替加環素中介，目前替加環素的耐藥機制主要為外排泵機制[18]，該株替加環素不敏感株可能存在其他耐藥機制。所有CRKP均未檢出多粘菌素的耐藥基因，目前認為多黏菌素聯合碳青霉烯類抗菌藥物或其他抗菌藥物是治療CRKP感染的有效方案。

28株CRKP的耐藥表型和耐藥基因在β-內酰胺類和阿米卡星的符合率均為100%。因此，通過對菌株的基因型檢測，能夠很好的預測細菌的耐藥表型，對指導臨床抗菌藥物的選擇有很大的幫助。

綜上所述，我院的CRKP耐藥嚴重，同時攜帶多種的耐藥基因，呈現泛耐藥表型，應加強細菌耐藥性監測，同時制定嚴格的院感防控措施，防止其在醫院內的傳播和流行。

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