血清Gd-IgA1水平與IgA腎病患者臨床及病理特點(diǎn)的關(guān)系分析*

肖勇 賀海東 胡屏 孫蔚倩 徐旭東 唐余燕

IgA腎病（IgAN）是全球范圍內(nèi)也是國內(nèi)最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，約占腎活檢患者的30%～45%，病理特征主要是腎小球系膜區(qū)以IgA為主的免疫復(fù)合物沉積，其臨床表現(xiàn)多樣，主要表現(xiàn)為鏡下血尿，可伴有不同程度的蛋白尿、水腫等癥狀。由于IgAN發(fā)病原因不清，基礎(chǔ)機(jī)制未明，目前臨床尚缺乏統(tǒng)一的治療方法。臨床醫(yī)師通常將尿蛋白含量作為指導(dǎo)IgAN治療及預(yù)后判斷的重要指標(biāo)，大量蛋白尿（＞1 g/L）提示腎臟病理損傷嚴(yán)重，腎功能衰退進(jìn)展較快，需要積極干預(yù)。但是對于輕度蛋白尿（＜1 g/d）的IgAN患者的治療與預(yù)后，缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，尤其是在激素使用方面存有爭議[1-4]。盡管腎穿刺是目前IgAN診斷及判斷預(yù)后的最佳方法，但考慮其有創(chuàng)性及風(fēng)險性，不宜反復(fù)進(jìn)行，所以亟待尋找能反映IgAN病情的指標(biāo)。本項(xiàng)目組近年來一直致力于少量蛋白尿（＜1 g/d）IgAN患者的治療與預(yù)后研究，前期臨床研究發(fā)現(xiàn)有一部分少量蛋白尿IgAN患者的腎臟病理改變較重，將這部分患者分為兩組，一組給予激素及常規(guī)ACEI/ARB聯(lián)合治療，作為實(shí)驗(yàn)組，一組僅給予激素及常規(guī)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑或血管緊張素Ⅱ受體抑制劑（ACEI/ARB）治療作為對照組，隨訪3年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，治療組尿蛋白量顯著減少；中等量蛋白尿、腎小球?yàn)V過率（eGFR）下降的終點(diǎn)事件發(fā)生率顯著降低[5-7]。該臨床研究結(jié)果顯示，通過臨床蛋白尿量來指導(dǎo)IgAN的治療及預(yù)后存在缺陷，一部分少量蛋白尿患者腎臟病理損傷嚴(yán)重，腎功能衰退進(jìn)展較快，錯失治療時機(jī)，導(dǎo)致終末期腎病，給家庭及社會造成巨大負(fù)擔(dān)。因此，尋找能反映IgAN病變程度和預(yù)后的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物具有重要臨床意義。

近年來的大量研究表明異常糖基化的多聚IgA1（Gd-IgA1）被稱為“致腎病IgA”，是IgAN的關(guān)鍵致病因子[8，9]，而目前對于Gd-IgA1與IgAN患者臨床及病理特點(diǎn)的研究較少，其能否反映IgAN的病情目前尚不清楚。因此本研究旨在探討血清Gd-IgA1水平與IgAN患者臨床病理特點(diǎn)及激素治療后反應(yīng)的關(guān)系，為臨床指導(dǎo)IgAN的診斷與治療提供新的思路。

對象與方法

1 對象 前瞻性收集2018年1月～2018年12月本科室住院的慢性腎炎及腎病綜合征患者血清，保存于–80℃以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分成三組，以腎活檢證實(shí)為IgAN并同意使用激素治療的患者作為實(shí)驗(yàn)組（40例），以腎活檢證實(shí)為膜性腎病患者作為疾病對照組（20例），以我院體檢中心健康體檢者作為空白對照組（20例），入選標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲，既往未接受糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑或腎移植治療，排除合并感染、腫瘤、妊娠等情況；eGFR均≥50 mL?min-1?（1.73m2）-1。所有標(biāo)本均已獲得受試者知情同意，并得到閔行區(qū)中心醫(yī)院倫理委員會的批準(zhǔn)。批件號：2018-010-01K。收集上述三組外周血5 mL，離心并收集血清，同時收集IgAN激素治療1個月后的血清，利用KM55 ELISA試劑盒檢測上述血清樣本中Gd-IgA1水平，收集臨床生化指標(biāo)資料，統(tǒng)計分析Gd-IgA1與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性，并對上述IgAN患者的腎活檢病理切片進(jìn)行Haas分級，對分級結(jié)果與Gd-IgA1水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 方法

2.1 主要試劑：患者腎功能、24 h尿蛋白定量、IgA水平為患者住院期間本院檢驗(yàn)科檢測，同時使用人半乳糖缺乏IgA1（Gd-IgA1）特異性抗體KM55酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒檢測血清Gd-IgA1，購自日本IBL公司，批號1L-803，貨號27600。

2.2 收集標(biāo)本：所有患者活檢當(dāng)日清晨空腹采血5 mL，即時分離血清，吸入1.5 mL EP管，分裝為3小管，貼好標(biāo)簽，放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩５怯浕颊咝畔ⅲ_診IgAN及膜性腎病的患者取出標(biāo)本用于后續(xù)試驗(yàn)，入選IgAN實(shí)驗(yàn)組的患者均單用甲潑尼龍激素治療，劑量根據(jù)體重計算（0.8 mg?kg-1?d-1）。患者出院后每2～4周門診隨訪1次，治療1個月隨訪時再次留取外周血5 mL，離心留取血清放入–80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ELISA試劑盒檢測：樣本為上述制備的外周血血清；依據(jù)試劑盒說明書，先將標(biāo)準(zhǔn)品及血清樣本各50 μL分別加入各孔中，然后每孔加入50 μL酶聯(lián)親和物，37℃溫育60 min后，倒掉孔內(nèi)液體；利用稀釋的洗滌液反復(fù)沖洗5遍，加入顯色液，室溫下避光反應(yīng)15 min，隨后每孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（A）值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出Gd-IgA1的水平，以mg/L作為單位。

2.4 相關(guān)性分析：通過pearson相關(guān)性分析對IgAN患者血清Gd-IgA1水平與24 h尿蛋白量進(jìn)行統(tǒng)計分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0及Graph Pad Prism5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean）表示，非正態(tài)分布計量資料以中位數(shù)（最小值-最大值）表示。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用One-way ANOVA，多個變量間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用pearson分析方法。

結(jié) 果

1 患者一般資料 實(shí)驗(yàn)組及對照組年齡、性別比例、病程等差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，IgAN組血清肌酐高于膜性腎病組，24 h尿蛋白定量低于膜性腎病組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩組組間eGFR差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組及對照組的一般資料

2 各組血清Gd-IgA1水平 根據(jù)文獻(xiàn)，采用KM55 ELISA試劑盒檢測各組血清樣本Gd-IgA1水平[9]，與正常組（3.56±0.30）mg/L及膜性腎病組（3.40±0.41）mg/L相比，IgAN患者組Gd-IgA1（9.44±0.74）mg/L水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P均＜0.001）；并且經(jīng)激素治療1個月后，IgAN患者Gd-IgA1（7.43±0.51）mg/L水平較治療前下降（t=2.24，P=0.03）。正常組與膜性腎病組Gd-IgA1水平差別無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 各組血清Gd-IgA1水平

3 Gd-IgA1水平與IgAN患者24 h尿蛋白定量的關(guān)系 通過相關(guān)性分析IgAN患者血清Gd-IgA1水平與24 h尿蛋白定量的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清Gd-IgA1水平與24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)（r=0.70，P=0.006，R=0.49），提示血清Gd-IgA1與IgAN患者的病情及預(yù)后相關(guān)（圖2）。

圖2 IgAN 患者血清Gd-IgA1水平與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性

4 不同Haas分型患者血清Gd-IgA1水平 為進(jìn)一步分析Gd-IgA1與IgAN患者病情的相關(guān)性，依據(jù)Haas分型標(biāo)準(zhǔn)[10]，將經(jīng)腎活檢證實(shí)為IgAN的40例患者進(jìn)行分組，分別為Haas Ⅰ型、Haas Ⅱ型、Haas Ⅲ型、Haas Ⅳ型、Haas Ⅴ型，比較各組血清Gd-IgA1水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gd-IgA1水平與IgAN患者的腎臟病理分級相關(guān)，Gd-IgA1水平隨IgAN Hass分級的升高而升高（圖3）。

圖3 不同Haas分型患者的Gd-IgA1水平

討 論

由于IgA1鉸鏈區(qū)糖基化缺陷（Gd-IgA1）在IgAN發(fā)病及疾病進(jìn)展中有重要作用，國內(nèi)外諸多研究小組關(guān)注Gd-IgA1的形成過程及機(jī)制。目前已明確，人體內(nèi)的IgA分子具有兩個亞型，分別為IgA1和IgA2，均可以單體（mIgA）和多聚體（pIgA）的形式存在。IgA1與IgA2的主要區(qū)別點(diǎn)在于IgA1具有鉸鏈區(qū)，此鉸鏈區(qū)由13個氨基酸組成，而每個鉸鏈區(qū)又有6個O-聚糖位點(diǎn)，主要由蘇氨酸和絲氨酸構(gòu)成[11]。IgA1糖基化過程是發(fā)生在鉸鏈區(qū)，通過β-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶（C1GalT1）及其特異性分子伴侶Cosmc相互協(xié)同，由UDP-半乳糖載體將半乳糖轉(zhuǎn)移至IgA1的β-1，3位乙酰基半乳糖胺殘基上，完成IgA1的糖基化修飾。近年的研究證實(shí)Gd-IgA1是IgAN發(fā)生及發(fā)展中的關(guān)鍵致病因子，但形成Gd-IgA1的機(jī)制尚不明確[12，13]。研究表明，IgA1脫去過多的涎酸或（和）半乳糖稱為低糖基化IgA1或異常糖基化IgA1，表現(xiàn)為O型聚糖鏈半乳糖基化程度降低，而N-乙酰半乳糖胺增加，這種改變很可能是由于β-1，3-半乳糖苷轉(zhuǎn)移酶及其特異性分子伴侶Cosmc的功能變化及表達(dá)水平下降所致。該酶及分子伴侶活性降低時，單一N-乙酰半乳糖胺的O糖鏈增多，而半乳糖β1，3-N-乙酰半乳糖胺生成減少[14]。

目前研究表明，Gd-IgA1主要通過兩個方面導(dǎo)致IgAN發(fā)生及發(fā)展，一方面肝細(xì)胞表面脫涎酸糖蛋白的受體與Gd-IgA1的結(jié)合力降低，進(jìn)而肝臟對血清中Gd-IgA1的清除減少，導(dǎo)致其在機(jī)體內(nèi)濃度升高；另一方面血清中單體Gd-IgA1聚合為大分子多聚IgA1[15]，促進(jìn)了Gd-IgA1與腎小球系膜細(xì)胞、細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)合，從而誘發(fā)一系列炎癥免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)Gd-IgA1沉積及IgAN發(fā)生。

此外，研究表明，IgAN發(fā)病率及嚴(yán)重程度與腸道菌群失調(diào)密切相關(guān)，腸道菌群失調(diào)可能會導(dǎo)致腸道屏障破壞，有利于毒素經(jīng)腸粘膜吸收入體內(nèi)，激活腸粘膜結(jié)合淋巴組織（GALT），促進(jìn)局部B淋巴細(xì)胞增殖，從而Gd-IgA1分泌增多，最終導(dǎo)致腎小球系膜區(qū)IgA1沉積及IgAN發(fā)生[16]。已有研究報道，空腸彎曲菌和大腸桿菌等致病菌數(shù)量增加時可導(dǎo)致IgAN，IgAN患者血清中也常檢測到某些血清型大腸桿菌[17]。小鼠體內(nèi)研究證實(shí)，異常糖基化多聚體IgA和針對共生菌的特異IgA抗體大量存在于IgA腎病轉(zhuǎn)基因小鼠血清中，異常糖基化多聚體IgA則會沉積在腎小球系膜區(qū)，引起IgAN發(fā)病[18]。所以，腸道菌群失調(diào)可能是Gd-IgA1產(chǎn)生的原因。前期研究中我們同時分析了IgAN患者與正常健康人腸道菌群的變化，發(fā)現(xiàn)IgAN患者存在腸道菌群失調(diào)，有益菌如乳酸桿菌、雙歧桿菌及酪酸梭菌數(shù)量減少，而有害菌如梭桿菌、埃希氏桿菌及克雷伯菌數(shù)量增加。

本研究共納入經(jīng)腎組織活檢證實(shí)的IgAN患者40例，膜性腎病患者20例，健康對照者20例，結(jié)果表明，IgAN患者血清Gd-IgA1水平升高，與患者的24 h尿蛋白定量呈正相關(guān)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），并且經(jīng)激素治療1個月后，IgAN患者Gd-IgA1水平較治療前下降。且在IgAN患者中，血清Gd-IgA1水平隨Hass分級的增加而升高，提示血清Gd-IgA1可在一定程度上反映IgAN患者腎臟病理改變的嚴(yán)重程度。激素治療后Gd-IgA1水平較之前下降，此部分患者24 h尿蛋白量較之前減少，而正常組與膜性腎病組相比，Gd-IgA1水平無統(tǒng)計學(xué)意義，因此Gd-IgA1有可能成為IgAN診斷及治療的監(jiān)測標(biāo)準(zhǔn)。

綜上所述，血清Gd-IgA1可以為不能行腎組織活檢的患者提供一個初步診斷IgAN及判斷預(yù)后的新方法，其在診斷IgAN患者的應(yīng)用意義值得進(jìn)一步探討。由于研究經(jīng)費(fèi)的限制，本實(shí)驗(yàn)收集的標(biāo)本量較少，觀察時間尚短，希望能有更多較大規(guī)模的類似研究，尤其是納入不同治療階段的患者并對患者進(jìn)行長期隨訪等研究，為改善IgAN的治療監(jiān)測及判斷預(yù)后開拓新方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突