多發(fā)性骨髓瘤循環(huán)腫瘤漿細(xì)胞的免疫表型特征及其臨床意義*

蔡夢潔 梅仁 戴蘭 沈文紅 傅琤琤 朱明清

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一類克隆性漿細(xì)胞異常增殖的惡性血液疾病，發(fā)病率位于血液系統(tǒng)的第二位，其臨床表現(xiàn)差異較大，預(yù)后具有顯著異質(zhì)性。近年來，越來越多的研究者對MM患者外周血中循環(huán)腫瘤漿細(xì)胞（circle tumor plasma cell，CTPC）、腫瘤細(xì)胞DNA和RNA以及標(biāo)志蛋白的監(jiān)測開展了廣泛研究[1，2]。與骨髓檢測相比，CTPC具有以下三個優(yōu)勢：①CTPC的檢測侵襲性小，無顯著創(chuàng)傷；②由于外周血稀釋以及骨髓瘤細(xì)胞的灶性分布，骨髓標(biāo)本漿細(xì)胞比例準(zhǔn)確性不高，CTPC絕對計(jì)數(shù)更為精準(zhǔn)；③在MM診斷中，CTPC與骨髓瘤負(fù)荷具有相關(guān)性[1，3]。研究表明CTPC是MM的一個獨(dú)立可靠的預(yù)后指標(biāo)，對MM的診斷、判斷預(yù)后及復(fù)發(fā)具有重要意義。但是，關(guān)于MM患者CTPC免疫表型的研究甚少。本研究主要通過對CTPC與骨髓檢測結(jié)果的比較，探討CTPC數(shù)量和免疫表型在MM臨床評估中的意義。

對象與方法

1 研究對象 選取2016年12月～2020年8月蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科初診為多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的患者75例，中位年齡為58歲，男41例，女34例，診斷符合我國國內(nèi)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，CTPC–組為15例，中位年齡為58歲，男9例，女6例；CTPC+組為60例，中位年齡為57.5歲，男28例，女32例。兩組在性別和年齡上進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。

2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀：型號Navios（Beckman coulter公司，美國）。試劑：Kappa-FITC和Lambda-PE（Dako公司，丹麥），CD138-APC、CD38-APC750、CD45-KO、CD19-ECD、CD56-PC7、CD27-PB、CD81-APC700、CD117-PC5（Beckman coulter公司，美國），氯化銨溶血劑（QIAGEN公司，美國），破膜劑Intracell（Dako公司，丹麥）。

3 方法

3.1 十色流式細(xì)胞術(shù)：對初診患者采集外周血和骨髓各2 mL，均采用EDTA-K2進(jìn)行抗凝。取500 μL患者骨髓或外周血，按比例（1∶10）加入氯化銨溶血劑，漩渦振蕩混勻，靜置15 min；隨后加入5 mL PBS，1 500 r/min離心5 min洗滌2次，去上清；洗滌后的細(xì)胞（50～100 μL）加入8種膜抗體（CD19-ECD、CD117-PC5、CD56-PC7、CD138-APC、CD81-APC700、CD38-APC750、CD27-PB、CD45-KO）并混勻，室溫孵育15 min；加入100 μL固定劑A避光孵育15 min，用2 mL PBS 1 500 r/min離心5 min洗滌棄上清，先震蕩混勻沉淀細(xì)胞，然后加入100 μL破膜劑B，輕輕吹打混勻后，加入胞質(zhì)抗體（Kappa-FITC、Lambda-PE）輕輕混勻，室溫避光孵育30 min后，2 mL PBS 1 500 r/min離心5 min洗滌棄上清，細(xì)胞沉淀中加入500 μL PBS重懸，上機(jī)檢測。獲取100萬個白細(xì)胞，檢測到單克隆漿細(xì)胞≥LOD值（最低檢出限：2×10-5）為陽性。

3.2 細(xì)胞遺傳學(xué)：對初診患者的骨髓進(jìn)行FISH細(xì)胞遺傳學(xué)檢測，檢測主要包括IgH重排、1q21擴(kuò)增、13q14擴(kuò)增、p53缺失、Rb1缺失。如果在檢測過程中出現(xiàn)IgH重排陽性，則需要加做t（4；14）、t（11；14）、t（14；16）。將出現(xiàn)1q21擴(kuò)增、17p–、t（4；14）、t（14；16）定義為遺傳學(xué)高危，而未出現(xiàn)以上遺傳學(xué)改變的則定義為遺傳標(biāo)危。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以GraphPad Prism5軟件作圖表示，采用卡方檢驗(yàn)或Student.T檢驗(yàn)對CTPC+組和CTPC–組的差異進(jìn)行分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 分析CTPC與骨髓內(nèi)腫瘤細(xì)胞比例的相關(guān)性 我們通過多參數(shù)十色流式細(xì)胞術(shù)對初診MM患者外周血CTPC和骨髓中克隆性漿細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析，以CD38++CD138+CD45±設(shè)門圈定漿細(xì)胞。通過細(xì)胞免疫表型將多克隆性漿細(xì)胞定義為陰性，單克隆性漿細(xì)胞定義為陽性，我們將75例患者分類為：CTPC-和CTPC+兩組，CTPC–組為15例，CTPC+組為60例，CTPC陽性率為70.6%。首先，對CTPC+組CTPC（圖1A）和BM（圖1B）中克隆性漿細(xì)胞比例進(jìn)行Pearson分析，結(jié)果顯示，MM患者CTPC與BM中克隆性漿細(xì)胞比例呈正相關(guān)（γ=0.536 8，P＜0.000 1，圖1C）。隨后，我們又對CTPC-組BM和CTPC+組BM中克隆性漿細(xì)胞比例進(jìn)行分析，結(jié)果顯示兩者比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.08，圖1D）。以上結(jié)果表明，CTPC在PB中的比例與BM中漿細(xì)胞比例呈正相關(guān)，但是MM是否浸潤外周系統(tǒng)與骨髓負(fù)荷無顯著相關(guān)性，這可能與漿細(xì)胞的生物學(xué)特性或腫瘤微環(huán)境相關(guān)。

圖1 分析CTPC與骨髓內(nèi)腫瘤細(xì)胞比例的相關(guān)性

2 比較CPTC–組BM和CTPC+組BM克隆性漿細(xì)胞免疫表型的差異 為進(jìn)一步探索MM侵襲外周系統(tǒng)的原因，我們對CPTC–組BM和CTPC+組BM中克隆性漿細(xì)胞表型進(jìn)行分析。在CPTC–組BM克隆性漿細(xì)胞中，CD19陽性率為26.7%，CD56陽性率為86.7%，CD117陽性率為33.3%，CD81陽性率為53.3%。同時，在CTPC+組BM克隆性漿細(xì)胞中，CD19陽性率為5%，CD56陽性率為83.3%，CD117陽性率為13.3%，CD81陽性率為71.7%。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示兩組CD19和CD81表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），與CTPC-組相比，CTPC+組BM中克隆性漿細(xì)胞CD19表達(dá)降低，CD81表達(dá)升高（表1）。

表1 CTPC-組BM和CTPC+組BM克隆性漿細(xì)胞免疫表型的差異

3 比較CTPC+組PB和BM克隆性漿細(xì)胞免疫表型的差異 為進(jìn)一步探索浸潤外周的MM患者CTPC與原發(fā)骨髓中漿細(xì)胞免疫表型的差異，我們對CTPC+組中CTPC和BM中克隆性漿細(xì)胞進(jìn)行免疫表型分析。CTPC+組CTPC中CD19陽性率為16.7%，CD56陽性率為81.7%，CD117陽性率為6.7%，CD81陽性率為71.7%。同時，在CTPC+組BM克隆性漿細(xì)胞中，CD19，CD56，CD117和CD81陽性率顯示見表2。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示兩組Kappa，Lambda，CD19，CD56，CD81和CD117表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表2）。

表2 CTPC+組PB和BM克隆性漿細(xì)胞免疫表型的差異

4 CTPC陽性與預(yù)后相關(guān)指標(biāo)的聯(lián)系 為驗(yàn)證CTPC與多發(fā)性骨髓瘤預(yù)后的相關(guān)性，我們對兩組患者的β2-MG、細(xì)胞遺傳學(xué)以及CR之間的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，CTPC-組患者外周血中β2-MG的水平顯著低于CTPC+組（圖2，P=0.002），并且通過FISH檢測多發(fā)性骨髓瘤相關(guān)遺傳學(xué)改變，結(jié)果表明，CTPC–組患者骨髓遺傳學(xué)高危組數(shù)目顯著低于CTPC+組（CTPC–：6/14；CTPC+：51/53；P＜0.000 1）。通過對兩組患者接受治療后CR進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示CTPC-組和CTPC+組兩組的CR沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（CTPC–：7/12；CTPC+：16/50；P=0.09）。

圖2 CTPC–組和CTPC+組外周血中β2-MG水平的差異

討 論

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種B細(xì)胞源性的惡性增殖性血液系統(tǒng)疾病，由于早期臨床癥狀不顯著以及其灶性分布等特點(diǎn)，導(dǎo)致MM患者就診時誤診率很高[4]。目前，循環(huán)腫瘤漿細(xì)胞（circle tumor plasma cell，CTPC）的存在和數(shù)量與腫瘤的診斷、判斷預(yù)后和復(fù)發(fā)之間的聯(lián)系成為MM研究的新方向[5，6]。有研究表明，CTPC參與腫瘤的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)，LUZALBA等指出MM治療后，出現(xiàn)CTPC反映了獨(dú)特的腫瘤生物學(xué)特性（如腫瘤傳播特性），并且提出CTPC可作為判斷MM預(yù)后的一個獨(dú)立連續(xù)監(jiān)測指標(biāo)[7]。本研究通過對兩組預(yù)后相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果顯示，CTPC–組的β2-MG血清水平和遺傳學(xué)高危組數(shù)目顯著低于CTPC+組，但是兩組CR無顯著差異。

目前，流式細(xì)胞術(shù)在MM中的應(yīng)用價值已受到廣泛認(rèn)可，其主要應(yīng)用于MM的鑒別診斷、預(yù)后標(biāo)志物檢測、靶標(biāo)檢測以及微小殘留病灶的監(jiān)測[8]。本研究對我院75例明確診斷的MM患者進(jìn)行分組，以CTPC–為對照組，CTPC+作為實(shí)驗(yàn)組。并且，本研究對兩組之間BM漿細(xì)胞表型的差異以及CTPC+組CTPC與骨髓腫瘤負(fù)荷之間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。與CONSALVES等研究結(jié)果一致，本研究結(jié)果表明CTPC比例與BM中克隆性漿細(xì)胞比例呈正相關(guān)，可以反應(yīng)骨髓腫瘤細(xì)胞負(fù)荷[9，10]。然而，CTPC+組與CTPC–組BM中克隆性漿細(xì)胞比例無顯著差異，這表明MM是否浸潤外周系統(tǒng)與骨髓負(fù)荷無相關(guān)性。隨后，本研究對兩組BM中克隆性漿細(xì)胞表型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示CTPC+組CD19表達(dá)顯著低于CTPC-組，而CTPC+組CD81表達(dá)顯著高于CTPC–組。MAHMOUD等指出骨髓瘤系細(xì)胞CD19表達(dá)增強(qiáng)會阻滯細(xì)胞增殖，并且降低細(xì)胞致瘤性[10]，這與本研究結(jié)果一致。以上結(jié)果提示CD19低表達(dá)，CD81高表達(dá)可能是MM侵襲外周系統(tǒng)的特征之一。本研究結(jié)果還顯示CTPC+組CTPC與BM中克隆性漿細(xì)胞表型Kappa，Lambda，CD19，CD56，CD81和CD117表達(dá)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上所述，CTPC能夠提示骨髓腫瘤細(xì)胞負(fù)荷，并且BM中克隆性漿細(xì)胞低表達(dá)CD19、高表達(dá)CD81與BM浸潤外周具有相關(guān)性。與BM相比，CTPC的采集更為便捷，侵襲性更小，這推動了其在臨床的廣泛應(yīng)用。在統(tǒng)計(jì)分析過程中，本研究發(fā)現(xiàn)雖然兩者之間細(xì)胞表型總體無差異，但是個別病例CTPC與BM中克隆性漿細(xì)胞存在差異，這些不同表型的克隆性漿細(xì)胞是否可能是一個獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)需要進(jìn)一步隨訪研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突