三例伴有t（18；22）（q21；q11）慢性淋巴細胞白血病的細胞及分子遺傳學研究*

向鑫 劉恒芳 曾招 白淑瀟 岑建農 金松 沈宏杰 陳蘇寧 潘金蘭

位于18q21染色體上的BCL-2是一種癌基因，其蛋白具有抗凋亡功能，在腫瘤中通常發生過表達。在淋巴細胞增殖性疾病中，最常見的導致BCL-2過表達的機制為14和18號染色體易位，即t（14；18）（q32；q21），位于14q32的IGH基因與位于18q21的BCL-2基因并置，導致BCL-2基因過表達。此類染色體易位可見于80%～90%的濾泡淋巴瘤（follicular lymphoma，FL）和慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia，CLL）。而t（18；22）（q21；q11）核型比較少見，被認為是t（14；18）（q32；q21）的變異易位，分子研究發現，該異常導致BCL-2基因與位于22q11的IGL基因并置，同樣導致BCL-2基因過表達。目前為止，本中心發現3例t（18；22）（q21；q11）異常核型病例，并對其進行了FISH和全基因組測序等研究，現將結果匯報如下。

資料和方法

1 實驗方法

1.1 研究對象：我們回顧性篩查了2012年1月～2019年1月在蘇州大學第一附屬醫院進行染色體檢測的患者，3例為t（18；22）（q21；q11）異常，均為CLL，CLL的診斷符合《血液病診斷及療效標準》[1]。

1.2 染色體檢測：抽取患者骨髓或外周血，進行DSP30+IL-2刺激劑的培養，按常規方法制備染色體，再進行R顯帶和常規染色體核型分析。根據2016年國際人類細胞基因組命名體制[2]描述克隆性核型異常。

1.3 熒光原位雜交（FISH）檢測：例1患者復查時進行了CLL組套（13q14/Rb1，p53，cen12，ATM）和BCL-2重排的FISH檢測，例2和例3患者初診時均進行了BCL-2重排的FISH檢測，其中例3患者同時進行了CLL組套FISH。至少分析300個間期核細胞。利用OLYMPUS BX51熒光顯微鏡（日本OLYMPUS）捕獲FISH信號，并用VideoTest-FISH 2.0成像軟件（俄羅斯）掃描和捕獲圖像。

1.4 全基因組測序：例1患者的DNA被送至上海天昊公司進行人全基因組測序，gDNA文庫構建使用Illumina公司生產的TruSeq Nano DNA HT Sample prep Kit，按照廠家的標準流程進行。根據斷裂位點設計引物，采用PCR方法擴增，然后通過DNA電泳驗證斷裂位點。

2 臨床資料

2.1 例1患者：男性，64歲。2019年1月于本院門診就診，行骨穿進行檢測，骨髓細胞形態學顯示骨髓增生明顯活躍，淋巴細胞比例明顯增高占91.5%；骨髓淋巴細胞免疫分型顯示，可見82.1%的成熟克隆性B淋巴細胞為 CD5+、CD19+、CD20+、κ+、CD23±、FMC7±、CD10–、CD38–、λ–；患者同時檢測淋巴結組織免疫表型，結果與骨髓細胞免疫表型一致，具體結果見表1；二代測序顯示DNMT3AT突變；診斷為CLL。

表1 3例患者細胞免疫表型檢測結果

2.2 例2患者：外院送檢患者，男性，65歲。2018年11月初診時，骨髓淋巴細胞免疫分型顯示，49.2%的成熟克隆性B淋巴細胞為CD5+、CD19+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、CD20±、λ±，結果見表1；多重PCR結果陰性；IG基因重排陽性，TCR基因重排陽性；診斷為CLL。

2.3 例3患者：女性，44歲。2010年9月于本院門診就診，骨髓細胞形態學顯示淋巴細胞增殖性疾病可能，成熟淋巴細胞84.5%；骨髓淋巴細胞免疫分型顯示，94.6%的成熟克隆性B淋巴細胞為CD5+、CD19+、CD20+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、λ–。2015年4月再次對骨髓細胞進行免疫分型檢測，發現97.1%的成熟克隆性B淋巴細胞為CD5+、CD19+、CD20+、CD23+、CD10–、CD38–、FMC7–、κ–、λ+，與初診結果相比，初診時λ陰性，復查時λ轉為陽性，其它結果一致。2018年10月檢測IGHV突變率為9.7%。

結 果

1 染色體檢測 例1患者在初診和治療期間共行2次染色體檢測。初診時5個細胞為t（18；22）（q21；q11）同時伴有+12和體質性inv（9）異常，2個細胞為唯一inv（9）體質性異常；治療9個月后染色體結果仍舊沒有改變，6個細胞為唯一inv（9）異常，4個細胞為t（18；22）（q21；q11）同時伴有+12和inv（9）。例2患者初診時10個細胞均為t（18；22）（q21；q11）異常，治療6個月后3個細胞為t（18；22）（q21；q11）異常（圖1），17個細胞正常。例3患者初診時為正常核型，治療4年6個月后復查染色體，5個細胞為唯一t（18；22）（q21；q11）異常，2個細胞同時伴有13q–，3個細胞為正常核型，至2019年11月復查染色體已進展為伴有t（18；22）的復雜異常。

圖1 例2患者R顯帶染色體核型圖：46，XY，t（18；22）（q23；q11）

2 FISH 檢測 例1患者復查時CLL組套FISH結果為+12陽性75%，其余為陰性；BCL-2重排陽性25%。例2患者初診時BCL-2重排陽性60%，未行CLL組套FISH檢測。例3患者初診時CLL組套FISH檢測結果為13q–陽性51%，Rb1缺失陽性44%，其余為陰性；BCL-2重排陽性73%（圖2），治療后2次CLL組套FISH檢測結果仍舊為13q–陽性，比例分別為86%（Rb1 88%）和78%（Rb1 75%）。

圖2 例3患者骨髓細胞FISH結果

3 全基因組測序 例1患者DNA全基因組測序結果顯示累及18號和22號染色體（圖3）。18號染色體受累基因為BCL-2，22號染色體受累基因均為IGLL5。在DNA水平對基因測序結果進行了驗證，確定為BCL-2與IGLL5出現并置，并且RNA水平未發現有RNA轉錄本。

圖3 例1患者DNA全基因組測序結果

4 治療經過 例1患者診斷后予以口服留可燃治療，效果不佳，改用伊布替尼治療，口服伊布替尼1個月，因血小板下降，予以停用。定期復查血象，提示白細胞計數升高，隨后間斷口服伊布替尼治療。2019年10月因出現發熱，予以骨穿復查，形態顯示骨髓增生明顯活躍，淋巴細胞比例偏高占91%。淋巴細胞免疫分型顯示91.0%的CD5+CD10–成熟克隆性B淋巴細胞。后患者因醫保問題自行出院，未繼續治療。目前門診隨訪，血象控制不佳。例2患者診斷后予以3個療程FC方案治療，2019年4月復查，骨髓淋巴細胞免疫分型未見異常；2019年9月復查，骨髓淋巴細胞免疫分型顯示2.7%的CD5+成熟克隆性B淋巴細胞；患者未覺特殊不適，目前自覺癥狀良好。例3患者2010年9月予以4個療程FC方案化療后，病程未緩解。隨后歷經多次化療及臨床試驗，仍未緩解。2018年3月開始口服伊布替尼治療，2018年10月因反復發熱，停用伊布替尼。骨穿復查，形態顯示骨髓增生活躍，淋巴細胞占99%。淋巴瘤免疫分型顯示91.9%的CD5+成熟克隆性B淋巴細胞。骨髓活檢（大病理）提示符合小B細胞淋巴瘤/淋巴細胞白血病。淋巴結活檢顯示符合小B細胞淋巴瘤/淋巴細胞白血病。IGHV突變率為9.7%。之后于2019年4月繼續口服伊布替尼至今，目前血象正常。

討 論

超過80%的CLL患者有染色體異常，大多為13q–、+12、11q–、17p–等，而累及14q32/IGH重排的異常則非常少見，僅見于4%的CLL[3]。t（14；18）（q32；q21）核型是其中一種，在分子水平上位于14q32的IGH基因與位于18q21的BCL-2基因并置，導致BCL-2基因過表達，該異常被認為是FL的特征性異常，可見于90%以上的FL，少數見于CLL[4，5]。t（18；22）（q21；q11）被認為是t（14；18）的變異易位，在分子水平上位于22q11的IGL基因和位于18q21的BCL-2基因并置，同樣導致BCL-2基因過表達[7]。t（18；22）（q21；q11）異常最早由ADACHI等[8]于1989年首次報道，迄今為止共有32例報道，其中24例為CLL，3例為FL，3例為非特殊類型成熟B淋巴細胞腫瘤，2例為彌漫大B細胞淋巴瘤。這些資料表明，盡管t（14；18）異常大多見于FL，但其變異易位t（18；22）卻多見于CLL。盡管如此，t（18；22）（q21；q11）在CLL中總體發生率非常低。DICKER等[6]報道的132例CLL患者中僅1例為t（18；22）（q21；q11），發生率為0.76%。而本中心從2010年1月至今明確診斷為CLL的患者共1 035例，其中t（18；22）（q21；q11）僅3例，發生率約為0.29%，略低于文獻報道。根據文獻報道[9]，CLL中累及IGH的重排核型常常伴有+12，本組病例中例1所分析異常細胞均為t（18；22）同時伴有+12，例2中3個細胞t（18；22）為唯一異常，例3中5個細胞t（18；22）為唯一異常，2個細胞同時伴有13q–，表明該異常既可以作為唯一異常，又可以和CLL中的其它常見異常伴隨出現。

細胞免疫分型是CLL診斷最為重要的指標。一般而言，典型的CLL細胞為CD5+、CD10–，此外還表達其它相關指標，包括CD19、CD20、CD23、CD38、FMC7、κ、λ等。文獻報道的23例伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL病例中，14例患者具有較為詳盡的細胞免疫表型檢測結果，均為CD5+、CD10–；7例共表達CD19、CD20、CD23；1例僅表達CD19；2例CD19、CD23共表達；2例僅表達CD20；1例僅表達CD23；1例CD20和CD23共表達。另外，14例病例中，2例表達CD38；4例表達或弱表達FMC7[6，7，10-17]。本文3例CLL患者與文獻中報道的伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL類似，細胞免疫分型也均為CD5+、CD10–、CD19+、CD20+或±，與其它CLL相比，伴有t（18；22）（q21；q11）的CLL免疫表型無明顯改變。

研究發現，與t（14；18）相比，t（18；22）累及2個基因的斷裂點也不同。t（14；18）中，BCL-2基因大多為主要（mbr）和次要（mcr）斷裂位點，位于BCL-2的3'端（C端）或近端30kb處，而IGH斷裂點位于5'端（N端），發生易位后，BCL-2的3'端與IGH的5'端并置；而t（18；22）中，BCL-2的斷裂點均位于5'端（N端），又稱為變異簇區域（VCR），IGL斷裂點位于3'端（C端），易位使得BCL-2的5'端與IGL的3'端并置[18]，使得BCL-2基因過表達，導致惡性腫瘤的發生發展。本文3例患者均由FISH證實累及BCL-2基因的斷裂，例1患者進行了全基因組測序，證實t（18；22）易位累及18q21的BCL-2基因，且斷裂位點位于該基因的5'UTR區域，而22q11累及IGLL5基因，斷裂點位于該基因3'端的內含子，兩者發生了并置。有文獻報道，t（14；18）的變異易位患者，其BCL-2基因表達量甚至高于t（14；18）者，因無t（14；18）易位患者標本，故未能對3例患者進行BCL-2表達量的驗證。

根據文獻報道，伴有IGH易位的CLL患者其首次治療間隔時間（Time to first treatment，TFT）較低危組患者縮短，為預后中等或高危[19]。另有文獻認為，CLL中IGH與不同的對手基因易位，預后不同，t（14；18）/BCL-2-IGH易位者預后良好，而其它如t（14；19）/BCL-3-IGH易位者則與高危組CLL患者相似，預后不良[20]。t（18；22）/BCL-2-IGL為t（14；18）的變異易位，伴有該異常的病例是否具有與t（14；18）異常的CLL一樣的預后尚未可知。本文中例1和例2患者在初診時染色體結果均為t（18；22）異常，例3患者初診核型正常，治療后復查為t（18；22）異常核型，但也不能排除初診時的漏檢，因無標本，故未能進行BCL-2重排FISH檢測。3例患者均在初診時即被診斷為Rai III期和Binet C期，隨即進行了治療，表明該類患者TFT時間非常短。例1和例3在初診時即進行了CLL組套FISH檢測，例1為唯一+12，例3為唯一13q–，且伴有IGHV突變，2例患者FISH結果均未檢測到11q–和17p–等高危因子，根據目前的CLL預后評估體系判斷，患者分別為中危和低危組。但例1和例3患者治療過程中始終未能緩解，例2患者經過短暫的緩解（5個月）后復發，目前3例患者均存活，隨訪時間分別為26、28、126個月。盡管t（18；22）異常的CLL病例數較少，但從本組病例可以看出，伴有t（18；22）異常的CLL可能具有難治性和易復發等特點。由于例1和例2隨訪時間較短，t（18；22）異常對生存期是否有影響尚不清楚。

綜上所述，t（18；22）（q21；q11）作為t（14；18）（q32；q21）的變異易位，與t（14；18）異常具有不同的分子結構。其發生率非常低，多見于CLL，可能具有難治性和易復發等特點。因病例數太少，需要積累更多病例進行更加深入的研究才能完全闡明伴有該異常的CLL的分子生物學特征。另外，本組病例也表明，對CLL患者進行DSP30+IL-2刺激后再檢測染色體非常重要，有可能發現FISH檢測結果以外的異常信息。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突