AMPK信號通路在小鼠急性腎損傷發生中的作用

毛艷 盧麗 肖輝 劉瀟

急性腎損傷是一種常見的臨床危重病癥，多伴隨有腎纖維化[1]。當腎損傷發生后，氧供應突然減少，葡萄糖酵解代謝途徑供能不能滿足機體需要，加上代謝底物的減少進一步加重能量短缺，導致細胞水腫、細胞內鈣超載，從而引發一系列細胞損傷[2，3]。阿德福韋酯可導致腎損傷，機制與其在腎小管蓄積濃度過高有關，可用來構建小鼠急性腎損傷模型[4，5]。磷酸腺苷激活蛋白酶（adenosine phosphate activating protease，AMPK）被稱為能量代謝的“感受器”，是一種在細胞內調節能量代謝的重要蛋白激酶[6，7]。AMPK可通過直接磷酸化細胞內的一系列酶，或通過協同激活因子、磷酸化轉錄因子和協同抑制因子對代謝進行轉錄調控[8，9]。AMPK也可參與骨骼肌、肝臟、胰腺、下丘腦、脂肪等器官和組織的基因合成與蛋白代謝，從而保證機體的生理平衡[10，11]。本文通過建立阿德福韋酯小鼠急性腎損傷模型，探討AMPK信號通路在小鼠急性腎損傷發生中的作用。現總結報道如下。

資料與方法

1 研究材料 SPF級BALB/c雄性小鼠（48只）購自本地區實驗動物中心，許可證SCXK（2018-0007）。室內溫度20℃～28℃，濕度40%～60%，每籠6只，飼養環境通風良好，光線充足，自由攝食攝水。實驗前令動物在飼養環境中適應7天。阿德福韋酯片購自河北醫科大學制藥廠（國藥準字H20100172，批號20194422）。GAPDH內參抗體與AMPK、Keap-1多克隆抗體購自Sigma公司。

2 實驗方法與步驟

2.1 小鼠分組與處理：將所有小鼠隨機分為兩組，對照組與實驗組各24只。對照組：用等滲鹽水進行灌胃處理。實驗組：采用阿德福韋酯40 mg/kg灌胃處理，1次/周，持續2次。

2.2 檢測指標：在處理后2周、4周、6周各處死8只小鼠。①將血液標本加入離心管，靜置30 min，2 500 r/min離心15 min，取上層血清，采用全自動生化分析儀測定尿素氮（BUN）與肌酐（SCr）水平。②同時取小鼠的腎臟組織，–70℃冰箱保存，其中部分組織研磨成勻漿后，提取蛋白，根據BCA蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量，再將制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，采用Western blotting檢測腎組織中AMPK、Keap-1的表達，以GAPDH作為內參。③另外取部分腎臟組織用4%多聚甲醛固定，然后依次進行脫水、透明、浸蠟、包埋等操作，經蘇木精-伊紅染色后，在光鏡下觀察腎組織的病理學變化，腎臟的病理損害評分標準[12]：1分，腎間質炎性細胞浸潤；1分，腎間質充血；1分，細胞核固縮；1分，腎小管腔內有脫落、壞死的細胞；1分，上皮細胞顆粒變性；1分，腎小管顯著擴張、細胞扁平；0分，正常腎小管。分數越高，腎臟病理損害越嚴重。

3 統計學處理 選擇SPSS 22.00統計學軟件與Prime Graphpad軟件對計量數據進行統計學分析，計量數據以均數±標準差表示，對比方法為獨立樣本t檢驗，檢驗水準為a=0.05。P＜0.05表示差異有統計學意義。

結果

1 腎功能對比 實驗組處理后2周、4周、6周的血清BUN與SCr水平都顯著高于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組處理后不同時間點的腎功能對比（）

表1 兩組處理后不同時間點的腎功能對比（）

2 腎臟組織病理學評分對比 實驗組處理后2周、4周、6周的腎臟組織病理學評分都顯著高于對照組（P＜0.05）。見表2與圖1。

表2 兩組處理后不同時間點的腎臟組織病理學評分對比（分，）

表2 兩組處理后不同時間點的腎臟組織病理學評分對比（分，）

圖1 兩組腎臟組織病理特征（HE染色，×400，對照組：正常狀態；2周：腎間質充血；4周：細胞核固縮；6周：腎小管腔內有細胞脫落）

3 AMPK與Keap-1表達水平對比 實驗組處理后2周、4周、6周的腎臟組織AMPK與Keap-1蛋白相對表達水平都顯著高于對照組（P＜0.05）。見表3與圖2。

表3 兩組處理后不同時間點的腎臟組織AMPK與Keap-1表達水平對比（%，）

表3 兩組處理后不同時間點的腎臟組織AMPK與Keap-1表達水平對比（%，）

圖2 AMPK與Keap-1表達水平

討 論

急性腎損傷在臨床上比較常見，也是臨床危重患者最主要的死亡原因之一[13]。腎臟是除了肝臟以外多種藥物代謝的重要場所，當藥物經血液進入腎臟時，往往因濾過而被濃縮，容易導致腎小管受損[14，15]。其中阿德福韋酯對腎臟的損傷表現為腎小管的結構和功能改變，是構建急性腎損傷小鼠模型的常見方法[16]。本研究顯示實驗組處理后2周、4周、6周的血清BUN與SCr水平都顯著高于對照組（P＜0.05）。臨床研究也顯示在使用阿德福韋酯的過程中，表現為腎小球濾過率下降或SCr上升，提示患者存在腎功能損傷[17]。但是當前影響血清BUN與SCr的因素非常多，特別是嚴重急性腎損傷患者往往存在程度不等的營養不良，使得肝臟將肌酸轉化為肌酐的能力減弱，導致血清BUN與SCr很難真實反映腎功能的狀態[18，19]。

本研究顯示實驗組處理后2周、4周、6周的腎臟組織病理學評分都顯著高于對照組（P＜0.05）。腎組織病理形態學評分提示急性腎損傷的程度，其主要表現為腎臟形態結構顯著改變，可見腎小管擴張，腎小管上皮細胞腫脹和空泡變性，管腔內有管型和壞死脫落細胞，部分腎小管結構損傷，少量管腔內有蛋白性液體積聚等。

AMPK內含一個催化性α亞單位和調節性β、γ亞單位，AMP結合到γ亞單位后，使蘇氨酸172位點更易被磷酸化，變構激活復合體，造成胞內鈣離子水平變化[20，21]。AMPK可對低水平ATP做出反應，對補充細胞 ATP供應的信號轉導通路進行正向調控[22]。AMPK-Keap-1信號途徑在維持機體細胞內正常的氧化還原平衡方面發揮重要作用，且該信號通路廣泛存在于多細胞生物體內，在進化上保持高度保守[23]。腎損傷可激活AMPK，通過減少能量產生保護腎功能，進而削弱細胞線粒體功能，形成惡性循環。當腎損傷減輕后，Keap-1因子會進入細胞核重新與AMPK結合，并轉位到細胞質，使AMPK的表達處于低水平[24，25]。本研究顯示實驗組處理后2周、4周、6周的腎臟AMPK與Keap-1蛋白相對表達水平都顯著高于對照組（P＜0.05），表明小鼠急性腎損傷可伴隨有AMPK信號通路的激活。本研究也有一定的不足之處，對AMPK信號通路的機制闡述不夠深入，且樣本數量較少，將在后續研究中進一步分析。

綜上，小鼠急性腎損傷可激活AMPK信號通路，誘導AMPK與Keap-1表達量上升，導致腎臟組織損傷與腎功能下降。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突