冰凍保存PRP對IL-1β誘導的軟骨細胞炎癥反應的影響

楊曉亞 高裕華 劉素蕊 李燭

PRP是自體抗凝血經離心、分離制備的血小板濃縮物，其中高濃度的血小板活化后可釋放大量的生長因子，能有效促進組織愈合、細胞再生。自體PRP在臨床應用廣泛：可用于治療骨性關節炎、肌腱損傷、韌帶損傷；牙種植、牙槽骨重建；還可用于慢性難愈合創面如糖尿病足、燒燙傷的治療[1-4]。血小板的常規保存時間最長不超過5天，PRP使用指南、制備技術手冊都明確指出，PRP的制備需要“使用前床邊制備，制備后即刻使用”[5-7]。自體PRP治療的單次用量不大，如關節腔內PRP注射治療膝骨關節炎，推薦注射劑量3～8 mL[7,8]；自體PRP凝膠治療糖尿病足潰瘍單次用量5～10 mL[3,9]。對于多數疾病，自體PRP治療需多個療程。因此，幾十毫升新鮮全血制備的PRP只能滿足單次治療，臨床進行自體PRP治療需要頻繁采血，對患者及醫護人員來說都有一定的負擔。而用全自動血液成分分離機單采血小板，單次最多可采250 mL濃縮血小板，能滿足多次PRP治療所需。也有單位應用冷凍保存的PRP用于后續治療，本研究以體外骨關節炎模型著手，旨在探討不同凍存方法對PRP發揮生物學效應的影響，為合理利用自體PRP技術，保證臨床治療效果提供實驗依據。

材料與方法

1 主要設備及試劑 全自動血液成分分離機（四川南格爾XCF3000）及其配套管路。人血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）、人轉化生長因子β（Transforming Growth Factor-β，TGF-β）、胰島素樣生長因子1（Insulin like Growth Factor，IGF-1）及人IL-6 ELISA檢測試劑盒購自浙江聯科生物有限公司，人血小板衍生生長因子AB（Platelet Derived Growth Factor AB，PDGF-AB）ELISA檢測試劑盒購自美國Raybiotech公司。人SW1353細胞株（人軟骨肉瘤細胞）購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。高糖DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司，活細胞計數試劑盒（CCK-8試劑盒）購自同仁化學研究所。DMSO購自美國sigma公司。

2 PRP制備和激活 本實驗所用的PRP為全自動血液成分分離機采集的健康獻血者O型血小板。采集后將5人份血小板混合均勻，調整血小板計數至1 000×109/L，無菌條件下分裝至血小板保存袋中，采用不同溫度及方式凍存。凍存3個月后取出PRP，37℃水浴化凍，用相當于PRP體積10%的CaCl2注射液激活，待液體成膠凍狀以后，12 000 r/min，4℃離心5 min，將收集到的上清液樣本儲存于–80℃超低溫冰箱中。

3 實驗分組 PRP采用4種不同方式凍存3個月，分別記為A、B、C、D組。A組：無菌條件下向PRP中加入5% DMSO，混合均勻后–80℃凍存；B組：無菌條件下向PRP中加入5% DMSO，混合均勻后–20℃凍存；C組：–80℃直接凍存；D組：–20℃直接凍存。3個月后招募5名獻血者捐獻單采血小板，作為新鮮PRP來源，此組標記為E組。

4 PRP中生長因子含量測定 全部樣本收集完成后，用ELISA方法檢測樣品中生長因子含量，包括VEGF、PDGF-AB和IGF-1。操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

5 SW1353細胞培養及軟骨細胞炎癥模型的制備SW1353細胞使用DMEM培養基（10%胎牛血清），在37℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。當細胞鋪滿瓶底80%時進行傳代。取對數生長期的SW1353細胞，加入含IL-1β（10 ng/mL）培養基處理24 h，誘導炎癥反應制備軟骨細胞炎癥模型。而后棄去培養基，加入含有10% PRP的DMEM繼續培養（對照組用完全培養基培養）。實驗分組情況：A～E組為不同凍存方式的PRP處理組；對照組為常規完全培養基培養的SW1353細胞；IL-1β組為含IL-1β（10 ng/mL）的培養基培養的SW1353細胞。

6 CCK-8法檢測SW1353細胞增殖活性 將SW1353細胞以1×104/孔的濃度加入96孔培養板中，IL-1β（10 ng/mL）作用24 h誘導炎癥反應，之后用含不同儲存方式制備的10% PRP的DMEM繼續培養，對照組用完全培養基培養。24 h后，利用CCK-8試劑檢測細胞活性，酶標儀檢測450 nm處的吸光度值（A450nm）。

7 檢測軟骨細胞炎癥指標 收集上述各實驗組SW1 353細胞培養上清液，ELISA法檢測炎癥因子IL-6含量，實驗過程按照試劑盒說明書操作。

8 統計學分析 采用Excel 2013軟件整理數據，采用SPSS 13.0分析試驗數據。計量結果以均值±標準差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同保存條件對PRP凝膠中生長因子含量的影響ELISA方法檢測PRP凝膠上清液中三種生長因子含量，結果見表1。各冷凍保存組與新鮮PRP組相比，凝膠上清液中PDGF-AB含量無顯著差異，但對VEGF和IGF-1含量有一定影響。與新鮮PRP組相比，各冷凍保存組凝膠上清液中VEGF含量均不同程度減少（P值均＜0.05）；A組PRP凝膠上清液中IGF-1含量比E組略降，但差異不顯著（P=0.066）。B、C、D組與E組相比，IGF-1含量均顯著減少（三組P值均＜0.05）。

表1 PRP凝膠上清液中PDGF-AB、VEGF、IGF-1含量（，pg/mL）

表1 PRP凝膠上清液中PDGF-AB、VEGF、IGF-1含量（，pg/mL）

注：A組：DMSO–80℃凍存組，B組：DMSO–20℃凍存組，C組：–80℃凍存組，D組：–20℃凍存組，E組：新鮮PRP組。*與E組相比較，P＜0.05

2 PRP對SW1353軟骨炎癥模型細胞增殖的影響IL-1β作用24 h后，與未加IL-1β的對照組相比，SW 1353軟骨細胞增殖受到抑制，存活率為原來的87%（見表2）。加入新鮮PRP作用24 h后，與未加PRP的IL-1β組相比，SW1353細胞的增殖抑制緩解（P＜0.05）。A組PRP與E組相比，對軟骨炎癥模型細胞增殖促進作用無顯著差異（P＞0.05）。與未加PRP的IL-1β組相比，加入B、C、D組PRP對IL-1β誘導的軟骨細胞增殖抑制均沒有緩解作用（P值分別為0.145、0.215、0.280）；這三組細胞的增殖顯著低于E組PRP（P均＜0.05）。見表2。

表2 SW1353細胞增殖活性檢測

3 PRP對軟骨炎癥模型細胞炎癥因子IL-6表達的影響正常培養的SW1353細胞不分泌炎癥細胞因子IL-6，加入IL-1β（10 ng/mL）24 h后，SW1353細胞大量分泌IL-6。加入E組PRP后，SW1353細胞IL-6的分泌受到顯著抑制，與未加PRP的IL-1β組相比差異顯著（P＜0.05），表明新鮮制備的PRP能夠使軟骨細胞的炎癥反應得到緩解。其余各組凍存PRP在減少軟骨細胞炎癥因子IL-6分泌方面都能起到與新鮮PRP相當的效果，各組之間無顯著性差異（P均＞0.05）。見表3。

表3 SW1353細胞培養上清液中炎性細胞因子IL-6濃度（，pg/mL）

表3 SW1353細胞培養上清液中炎性細胞因子IL-6濃度（，pg/mL）

注：A組：DMSO–80℃凍存組，B組：DMSO–20℃凍存組，C組：–80℃凍存組，D組：–20℃凍存組，E組：新鮮PRP組。*與IL-1β組相比較，P＜0.05

討 論

本文主要探討PRP冷凍保存后生物活性的變化。實驗設置了四種凍存條件，分別是–20℃、–80℃直接凍存以及加入DMSO后–20℃、–80℃凍存。臨床上PRP治療往往持續2～3個月[10]，所以我們將凍存持續時間設為3個月。由于不同捐獻者的血小板存在個體差異[11]，因此，我們選用不同獻血者血小板混合物作為PRP來源，避免個體差異對實驗結果造成影響。PRP的生物學效應主要依賴于血小板活化后釋放的大量細胞因子，包括PDGF、TGF-β、VEGF、IGF-1、FGF等[12]。這些活性蛋白能促進細胞增殖，抑制細胞凋亡，并促進細胞外基質分泌。活化血小板分泌的細胞因子既能發揮各自的生物學效應，各細胞因子間還有協同作用[13]。PRP中生長因子的含量是評估其促受損組織修復的重要指標，選取三種細胞因子PDGF、VEGF和IGF-1進行檢測，發現僅PDGF-AB含量不受凍存的影響，VEGF和IGF-1含量都明顯減少，而DMSO保護劑–80℃凍存組IGF-1的含量和新鮮PRP組相當。與MUBIN HOSNUTER[14]和ALICE ROFFI[15]等的實驗結果相似，即經冷凍之后，PRP激活釋放的某些生長因子低于新鮮PRP。血小板活化后釋放的細胞因子絕大部分是預先合成的[16]，而細胞因子多為多肽類物質，理論上冷凍保存不會對其含量造成顯著影響，分析凍存影響PRP釋放生長因子的原因可能是冰凍對血小板造成的儲存損傷。在血小板儲存過程中，聚集功能降低，對多種激活劑的反應能力減弱[17]，冰凍保存后的血小板對激活劑CaCl2的反應性降低，導致儲存于α顆粒中的細胞因子不能完全釋放出來；這也能解釋加冷凍保護劑DMSO后，–80℃凍存的PRP上清液中IGF-1的含量未受影響。

我們用SW1353細胞制備軟骨細胞炎癥模型，驗證PRP冰凍保存后的抗炎效應。模型建成后，軟骨細胞存活率變低，并開始分泌炎癥細胞因子IL-6。新鮮PRP能夠緩解軟骨炎癥細胞增殖抑制，并降低IL-6的分泌水平。冰凍保存之后，只有加DMSO保護劑–80℃凍存的PRP在緩解軟骨炎癥細胞增殖抑制方面起到和新鮮PRP相似的效果，另外3組PRP對軟骨炎癥細胞增殖抑制沒有緩解作用。但是不管何種條件凍存，是否加凍存保護劑，凍存3個月之后的PRP都能有效抑制軟骨細胞IL-6的分泌。以上結果表明，凍存之后PRP的生物學活性受到一定的影響，PRP凝膠上清液中部分效應細胞因子含量減少，影響了其對炎癥軟骨細胞增殖的促進作用，DMSO作為凍存保護劑，在–80℃凍存過程中能保護血小板活性，因而凍存之后的PRP仍能有效緩解軟骨炎癥細胞增殖抑制。我們發現，冰凍保存并沒有影響PRP對軟骨炎癥細胞的抗炎效果，四組凍存后的PRP在體外都具有有效對抗軟骨細胞炎癥的作用。這可能是由于PRP活化后，上清液中活性因子的種類復雜，除細胞因子之外，還有其他生物活性成分如血漿蛋白等，冰凍保存雖然影響了部分細胞因子的濃度，但是PRP對抗軟骨炎癥的功能并無影響。

本研究檢測了四種凍存方式對PRP生物學效應的影響，結果顯示，加DMSO保護劑–80℃凍存的PRP活性上最接近新鮮PRP。在實際應用中，–20℃凍存是最容易實現的凍存方法，–80℃深低溫需要專用設備才能達到，一般臨床科室并不具備。冰凍保護劑是額外添加的物質，雖然DMSO在使用劑量范圍內被證明是安全的，但是它畢竟是一種生物毒性物質，可能會增加患者使用后不良副作用的風險[18]。我們的結果顯示不加冰凍保護劑–20℃直接凍存，雖然對PRP的細胞因子濃度以及促軟骨細胞增殖方面有一定影響，但是其在體外仍具備抑制軟骨細胞炎癥的作用。考慮到可操作性及最大限度避免副作用，臨床可以采用–20℃直接冰凍保存PRP。本研究樣本量有限，所采用的實驗方法如ELISA有一定的誤差，因此本研究的結果尚需要進一步的后續實驗來驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突