儲存紅細胞中表達降低的circRNA以及其靶基因預測的研究*

張怡宇 黃國清 王強 張勇剛 苑召虎 陳小潔 黃建云 李楠 魏亞明

在低溫儲存條件下，儲存紅細胞會發生一系列的變化，也稱為儲存損傷。氧化損傷和代謝障礙是儲存損傷的原因，而ATP減少、2,3-DPG變化、離子泵功能、RBC膜和細胞骨架的重組和破壞、血紅蛋白和氧化蛋白的結合、帶3蛋白的降解以及筏蛋白的變化是儲存損傷的具體表現[1]。在儲存過程中積累的部分生物反應調節劑（BRM）會充當輸血受血者的促炎劑，例如細胞因子、趨化因子、生物活性脂質和代謝產物[2]。如果將這些發生變化的血制品輸入到患者，有可能引起輸血不良反應。在低溫保存條件下，供體紅細胞的表現存在廣泛的遺傳變異性，所以在組學基礎上制定新途徑來減少儲存損傷也十分不易[3]。

在全血中，環狀RNA（circular RNA，circRNA）是轉錄組的天然成分[4]。circRNA呈閉合環形結構，在無核細胞中大量存在。它不易被核糖核酸酶R水解，而且比線性RNA更穩定，所以更適宜用作生物標記物[5，6]。除此外，circRNA是高效的miRNA海綿，通過不同的結合位點能吸附多個miRNA，通過解除miRNA對mRNA的抑制作用，來促進mRNA表達及蛋白翻譯，參與調節多種信號通路[7，8]。circRNA還可以起到存儲，分類或定位RBP（RNA結合蛋白）的作用，如Foxo3環狀RNA與特定蛋白質之間的相互作用顯示出可延緩細胞周期進程[4]。

在多數疾病中，circRNA上調和下調與具體的疾病機制密切相關。在無核細胞中，整個轉錄組呈降解趨勢。已有研究證明在儲存紅細胞中非編碼RNA之一的miRNA下調模式更為明顯[9]，而本研究中下調的circRNA數量遠大于上調的circRNA數量，研究下調的circRNA更具代表意義。下調的circRNA其作為儲存損傷標志物的候選者更為合理。基于這個背景，本研究對儲存20 d的紅細胞和新鮮紅細胞采用高通量測序，觀察下降明顯的circRNA的表達變化及circRNA所對應的miRNA的分子功能，用生物信息學方法分析下降明顯的circRNA、其靶miRNA及miRNA關聯的mRNA并進行PCR驗證，預測其功能以及作為儲存損傷標志物的可能性。

材料和方法

1 一般資料 血液標本為5名25～30歲O型健康合格獻血者的標本200 mL（人）份，與CPDA-1保存液混合，過濾去除白細胞后制成懸浮紅細胞，分別收集新鮮組（0 d）、20 d收集標本進行試驗。收集方法如下：以（1 000 g，20 min，4℃）為條件進行輕離心，在生物安全柜內將血漿層（去除血小板和血漿）吸走，留取紅細胞層，用PBS洗滌三次。其中3名健康者標本用來circRNA測序，所有5名健康者標本用來circRNA的RT-qPCR驗證。所有試驗均分為0和20 d 2組。研究獲本院醫學倫理委員會批準（K-2018-027-01）。

2 試劑與儀器 紅細胞保存液CPDA-1購自廣州費森尤斯卡比；0.9%生理鹽水購自佛山雙鶴藥業；PrimeScript RT Master reagent Kit with gDNA Eraser（perfect Real Time）、SYBR Premix Ex Taq Master MixⅡ、無酶水均購自日本TaKaRa公司；TRIzol-LS購自美國life公司；RNaseR購自美國Epicentre公司；一次性白細胞過濾輸血器購自南京雙威公司；自動紅細胞計數儀購自北京賽科希德公司；電熱恒溫培養箱購自上海精宏公司；低溫高速離心機購自美國Eppendorf公司；引物序列由上海捷瑞合成；使用qTOWER2.2購自德國analytikjena的PCR儀做qRTPCR檢測。

3 circRNA高通量測序檢測 3名健康者標本的新鮮紅細胞和4℃儲存20 d紅細胞分別提取總RNA儲存于-80℃，進行circRNA高通量測序。對0 d組、20 d組的6份標本（3份/組）做高通量測序。

4 circRNA的生物信息學方法與流程 對下調明顯的十個circRNA的類型、來源、新舊進行分析，最終完成其功能注釋。用circBase（http://circbase.org/）與mirTarBase（http://mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）完成數據庫注釋與靶向預測。然后對cirRNA作用miRNA進行靶標預測，所用軟件是mireap（http://mireap.sourceforge.net/），miranda（https://sourceforge.net/projects/mireap/），targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）。并將miRNA可能作用的mRNA也進行了關聯分析，所用軟件是mirTarBase（mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw/php/index.php）。

5 circRNA、miRNA、mRNA表達量的測定 采用qRT-PCR方法測定miRNA的相對表達量，具體方法參考文獻[10]。circRNA的引物如表1所示，miRNA及mRNA引物設計用軟件prime3（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）完成。

表1 qRT-PCR用到的引物

6 統計學處理 應用SPSS 16.0軟件和Graphpad Prism5軟件行配對t檢驗，數據以均數±標準差（）表示，P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 測序結果分析 紅細胞在儲存20 d對比0 d中，下調明顯的10個circRNA有：hsa_circ_0005413、novel_circ_0002503、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0049462、hsa_circ_0028281（圖1）。下調明顯的前10個circRNA有3條來自11號染色體，且這10個circRNA均來自外顯子（表2）。Novel命名的circRNA表示在紅細胞中發現的新circRNA，即目前未被circBase數據庫收錄的circRNA。

表2 circular RNA類型統計表

圖1 circRNA表達情況熱圖（n=3）

2 生物信息學預測結果 利用生物信息學軟件預測發現下降明顯的十個circRNA中，hsa_circ_0005413能海綿吸附hsa-miR-6748-3p，hsa-miR-6871-5p，hsamiR-7160-5p，其中hsa-miR-6871-5p能靶向作用于BACH1（basic leucine zipper transcription factor 1，

堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子1）、SOD2（superoxide dismutase 2，超氧化物歧化酶2）等mRNA；hsamiR-7160-5p能靶向作用于EIF2AK2（eukaryotic translation initiation factor 2-alpha kinase 2，真核翻譯起始因子2-α激酶2）、CASP8（caspase 8，半胱天冬酶8）等mRNA。hsa_circ_0008937能海綿吸附hsa-miR-6778-3p，hsa-miR-6778-3p能靶向作用于SH3BP5（SH3-domain binding protein 5，SH3-結構域結合蛋白5）、AKAP2（A kinase（PRKA）anchor protein 2，激酶（PRKA）錨蛋白2）、PPP1R12C（protein phosphatase 1，蛋白磷酸酶1）等mRNA。hsa_circ_0040340能海綿吸附hsa-miR-122-5p、hsamiR-3173-5p、hsa-miR-5590-5p，其中hsa-miR-122-5p能靶向作用于MAPK1（mitogen-activated protein kinase 1，絲裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2L1（BCL2-like 12（proline rich），BCL2樣12（富含脯氨酸））、CDK4（cyclin-dependent kinase 4，細胞周期蛋白依賴性激酶4）等mRNA；Hsa-miR-3173-5p能靶向作用于CPEB4（cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4，胞質聚腺苷酸化元件結合蛋白4）、SCAMP2（secretory carrier membrane protein 2，分泌載體膜蛋白2）、CAMKV（CaM kinase-like vesicle-associated，CaM激酶樣囊泡相關）、ARHGEF2（Rho guanine nucleotide exchange factor（GEF）2，Rho鳥嘌呤核苷酸交換因子（GEF）2）。hsa_circ_0007995能海綿吸附hsa-miR-1254、hsa-miR-4534、hsa-miR-6751-5p、hsa-miR-99a-3p，其中Hsa-miR-4534能靶向作用于TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）、EMC3（ER membrane protein complex subunit 3，ER膜蛋白復合物亞基3）、THAP1（THAP domain containing 1，THAP域包含1）、PER2（period circadian clock 2，周期生物鐘2）、SEMA7A（semaphorin 7A，GPI膜錨）、CAPZA1（capping protein（actin filament）muscle Z-line，alpha 1，旋蓋蛋白（肌動蛋白絲）肌肉Z線，alpha 1）、MAP1LC3B（microtubuleassociated protein 1 light chain 3 beta，微管相關蛋白1輕鏈3 beta）、ABCA6（ATP-binding cassette 6，ATP結合盒成員6）、PGM2L1（phosphoglucomutase 2-like 1，磷酸葡萄糖突變酶2樣1）、TMOD3（tropomodulin 3，原肌鈣蛋白3）、PPP2R1B（protein phosphatase 2，regulatory subunit A，beta；蛋白磷酸酶2，調節亞基A，β）、TMEM214（transmembrane protein 214，跨膜蛋白214）。novel_circ_0000402能海綿吸附hsa-miR-1273g-3p、hsa-miR-1285-3p、hsamiR-4304，其中hsa-miR-1285-3p能靶向作用于PRSS21（proteaseserine21，蛋白酶絲氨酸21）、MRI1（methylthioribose-1-phosphate isomerase 1，甲基硫代核糖-1-磷酸異構酶1）、UFM1（ubiquitin-fold modifier 1，泛素倍數調節劑1）。

3 circRNA的表達量 熒光定量PCR顯示相對于新鮮紅細胞組，儲存20 d組的hsa_circ_0005413、hsa_circ_0008937、hsa_circ_0040340、hsa_circ_0003126、hsa_circ_0007995、hsa_circ_0023937、novel_circ_0000402、hsa_circ_0028281表達量顯著下降（P＜0.05，表3）。其中novel_circ_0002503和hsa_circ_0049462未被RTPCR所驗證，可能因為其片段比較短。

表3 circRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

表3 circRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

4 miRNA的表達量 由于circRNA能海綿吸附miRNA，而miRNA能靶向作用于mRNA的性質，許多研究證實了競爭性內源RNA-（competing endogenous RNAs，ceRNA）機制的存在。根據ceRNA機制原理，circRNA和mRNA的表達量變化應是同一方向，而circRNA和miRNA的表達量變化應是相反方向。之前的芯片研究揭示了紅細胞儲存中miRNA的表達量變化[9]。本研究在生物信息學預測到的miRNA中，選取了在芯片中表達量升高的miRNA做qRT-PCR驗證。熒光定量PCR顯示相對于新鮮紅細胞組，儲存20天組的hsa-miR-7160-5p、hsamiR-122-5p、hsa-miR-4534的表達量顯著上升（P＜0.05，表4）。

表4 miRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

表4 miRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

5 mRNA的表達量 在生物信息學預測結果基礎上，對預測得到的靶mRNA查閱大量文獻。篩選出在儲存損傷中發揮重大作用的3條mRNA進行RT-qPCR驗證。熒光定量PCR顯示相對于新鮮紅細胞組，儲存20 d組的CASP8、CDK4、TMOD3顯著下降（P＜0.05，表5）。

表5 mRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

表5 mRNA的qRT-PCR表達結果（，n=5）

6 與儲存損傷有關的circRNA-miRNA-mRNA通路分析 經過qRT-PCR驗證及文獻查閱，初步發現hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3軸，參與了儲存損傷的生物學過程。

討 論

本研究從circRNA-miRNA-mRNA網絡角度為紅細胞儲存損傷機理和預防提供了新見解。hsa_circ_0005413-hsa-miR-7160-5p-CASP8、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-CDK4、hsa_circ_0007995-hsa-miR-4534-TMOD3軸是本文全新發現。這3條軸的miRNA分子中，暫未有hsa-miR-7160-5p的研究，miR-122在肝脂肪變性中上調，與衰老相關，并在多種人體組織中過表達[11-13]，hsa-miR-4534在健康人和2型糖尿病血清樣本中的表達有顯著差異[14]。這3條軸中的mRNA分子中，caspase-3和-8在成熟紅細胞大量存在，由于存在這些蛋白酶，缺少線粒體凋亡級聯反應的必需成分如caspase-9、Apaf-1和細胞色素c的紅細胞可以進入凋亡途徑[15]。細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclindependent kinase 4，CDK4）在人紅細胞中存在，CDK4抑制劑能減弱氧化應激下的PS暴露，降低紅細胞凋亡率[16]。（Tropomodulin3，TMOD3）是一種結合并覆蓋在紅系和非紅系細胞的肌動蛋白絲尖端的蛋白質，TMOD3的破壞會使紅細胞生成受損，它介導的肌動蛋白重塑對于成紅細胞-巨噬細胞粘附，協調細胞周期與分化以及F-肌動蛋白組裝和成紅細胞去核過程中的重塑中起著重要作用[17]。另外TMOD3對肌動蛋白絲的覆蓋不足可能會導致尖端的肌動蛋白動力學更大，絲長重新分布導致血影蛋白-肌動蛋白網狀結構連接不規則和減弱，導致紅細胞膜不穩定[18]。可以初步推測，hsa_circ_0007995可通過吸附hsa-miR-4534下調TMOD3的表達導致紅細胞膜不穩定性增強。hsa_circ_0005413吸附hsa-miR-7160-5p，下調CASP8的表達阻止紅細胞凋亡通路，hsa_circ_0040340能吸附hsa-miR-122-5p下調CDK4的表達，降低紅細胞凋亡率。hsa_circ_0005413和hsa_circ_0040340可能是潛在的延緩儲存損傷的有益基因。

根據本研究的生物信息學預測結果，未經過RT-qPCR驗證的hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-BACH1、hsa_circ_0005413-hsa-miR-6871-5p-SOD2、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-MAPK1、hsa_circ_0040340-hsa-miR-122-5p-BCL2L1、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-PER2、hsa_circ_0007995—Hsa-miR-4534-SEMA7A途徑有可能在紅細胞生理過程發揮了重要作用。例如，轉錄因子Bach1可能參與成紅細胞對缺鐵狀態的反應，它通過與血紅素的直接結合而失活[19]。血紅素通過轉錄因子Bach1在紅系細胞中正調控基因座控制區域的β-珠蛋白表達[20]。超氧化物歧化酶2（super oxide dismutases，SOD2）缺乏將導致小鼠紅細胞變形能力降低和血紅素降解增加[21]。紅細胞祖細胞中SOD2的丟失會導致蛋白質氧化損傷增強，膜變形改變以及紅細胞存活率降低[22]。絲裂原相關蛋白激酶1（mitogen-associated protein kinase 1，MAPK1），成紅細胞巨噬細胞蛋白（Emp）在紅細胞和巨噬細胞中均表達，Emp的下調會影響絲裂原相關蛋白激酶1（MAPK1）和胸腺瘤病毒原癌基因（AKT-1）的表達，從而導致細胞運動異常[23]。Bcl-2樣蛋白1（BCL2L1）屬于抗凋亡因子，有間接證據表明bcl-x可能在紅系細胞的凋亡中起作用[24]。有研究表明，將c-MYC和BCL-XL轉導至多能造血祖細胞中過表達，使糖蛋白A（+）成紅細胞能夠持續自我復制[25]。周期生物鐘基因Per2（Period circadian clock genes 2，Per2）具有非晝夜節律功能，Per2耗竭導致紅細胞代謝譜發生重大變化，包括乳酸增加和ATP水平降低，所以它的丟失會大大減少紅細胞的壽命[26]。JMH血型系統由6種位于Sema7A蛋白上的抗原組成，（Semaphorin 7A，Sema7A）是攜帶JMH血型抗原的蛋白質，參與免疫反應，在軸突生長和引導中起重要作用[27]。

除此以外，有些靶mRNA還能誘導circRNA環化，即促進circRNA的生成。如真核生物起始因子4A3（Eukaryotic initiation factor 4A3，EIF4A3）可誘導circMMP9環化，并增加了多形性膠質母細胞瘤細胞中circMMP9的表達[28]。這種調控機制是否在紅細胞儲存損傷中發揮作用還需要進一步研究。

在本文中，選取了高通量測序對circRNA分子進行研究。首先，選取下降明顯的十個circRNA做PCR驗證，其次用circBase和mirTarBase完成數據庫注釋與靶向預測，推測了circRNA海綿吸附miRNA的潛在功能。第三，將miRNA可能作用的mRNA也進行了關聯分析，構建了circRNA-miRNA-mRNA通路。本研究的一個局限是，并未對所有差異表達的circRNA進行PCR驗證和靶基因預測分析。但是我們的數據為紅細胞儲存損傷中的circRNA分子機制研究提供了新基礎，并發現某些circRNA可能與儲存損傷密切相關。利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突