滇重樓產業鏈上游質量控制關鍵影響因素探究

陳達菊楊 青茹瑞紅陳顯梅楊羚鈺申世安

（云南省文山壯族苗族自治州農業科學院，云南 文山663099）

滇重樓Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.??Mazz 是黑藥花科重樓屬多年生草本植物［1］，是傳統名貴中藥材［2］，2015年《中國藥典》 收錄主要種之一［3］。現代研究表明，重樓具有抗腫瘤、抗缺血性損傷、抗病毒、免疫調節、止血、鎮痛、抗菌、抗血小板聚集、抗炎等生物活性，是云南白藥、宮血寧膠囊、樓蓮膠囊、清咽膠囊、季德勝蛇藥片、熱毒清膠囊、金復康口服液等中成藥的主要原料［4?6］。近年來，人工馴化成為解決市場供需矛盾、實現重樓資源有效保護和可持續利用的主要途徑，但是由于種源混雜，采收沒有科學的參考指數，藥材質量和收獲量得不到保證成為了亟待解決的主要問題。

從1962年起，國內對重樓的研究就開始興起［7］，但是對收獲期的研究較少，均根據滇重樓皂苷含量的多少來確定收獲期，且各研究者研究得出的結果不一，略顯片面，無法作為滇重樓種植業的參考依據。重樓皂苷含量是重樓藥材的質量評價指標之一，除了4種《中國藥典》 規定的皂苷外，重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷H 和薯蕷皂苷也具有很好的生物活性，且含量較高［8?10］。本研究基于HPLC?DAD 對滇重樓7種主要皂苷含量的動態變化以及滇重樓上游質量控制關鍵點進行了系統分析，并在此基礎上設定了收獲指數。以期該研究結果為滇重樓種植業和藥材上游質量控制提供科學的理論依據和手段，從而保證滇重樓藥材的質量和藥農的收益，同時為其他中藥材質量評價提供參考依據。

1 材料

Agilent 1260 HPLC?UV（美 國Agilent 公 司）；DZF?6050MBE型電熱恒溫真空干燥箱（上海博訊實業有限公司）；BRANDSON 8510型超聲波清洗機（40 kHz，美國BRANDSON 公司）；eppendorf 5804 離心機、eppendorf 移液器（德國Eppendorf 公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius 公司）；boekel 干浴鍋（美國Boekel 公司）。

重樓皂苷Ⅰ（批號HN1116XB13）、重樓皂苷Ⅱ（批號R2206F4766）、重樓皂苷Ⅵ（批號Z10F3B1）、重樓皂苷Ⅶ（批號R26A6F2816）、重樓皂苷Ⅴ（批號Y19F7H9835）、重樓皂苷H（批號C12A8G33615）和薯蕷皂苷（批號P20J7F18116）對照品購自上海源葉生物科技有限公司。色譜純甲醇、乙腈購于美國賽默飛公司，其他試劑均為分析純。

滇樓新鮮根莖根據實驗需要分別收集于云南省內不同地區、文山州內不同縣市等，皂苷含量動態變化的實驗材料取自同一個基地、同一個類型。樣品設2個重復，滇重樓基源由中國科學院昆明植物研究所李恒鑒定為正品。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Thermo C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相水（A）? 乙腈（B），梯度洗脫（0～40 min，35%～40%B；40～50 min，55%～60%B；60～70 min，35%B）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。按照上述色譜條件進行分析，各成分分離度良好，色譜圖見圖1～2。

2.2 對照品溶液制備分別精密稱定減壓干燥至恒定質量的重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ、重樓皂苷Ⅴ、重樓皂苷H 和薯蕷皂苷對照品適量，加純甲醇溶解并制備成混合質量濃度分別為0.414、0.512、0.103、0.313、0.668、0.204、0.107 mg／mL 的對照品貯備液。精確量取對照品混合貯備液1.0、2.5、5.0、7.5、10 mL添加甲醇適量，精密定容到10 mL，得到不同梯度濃度對照品。置于4 ℃的冰箱內，臨用前經0.22 μm 微孔濾膜過濾，備用。

2.3 線性關系考察 精確吸取“2.2”項下系列混合對照品溶液各20 μL，在“2.1”色譜條件下進樣，以對照品的峰面積縱坐標（Y），相應的質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，得回歸方程分別為重樓皂苷ⅠY＝9 460.4X－4.900 8（r＝0.999 4）；重樓皂苷ⅡY＝7 080.4X＋7.949 9（r＝0.998 3）；重樓皂苷ⅥY＝9 842.1X－0.313（r＝0.999 4）；重樓皂苷ⅦY＝6 668.1X＋12.945（r＝0.999 5）；重樓皂苷ⅤY＝10 865X＋1.942 2（r＝0.999 4）；重樓皂苷HY＝7 294.1X－23.8（r＝0.999 4）；薯蕷皂苷Y＝9 691.7X＋59.899（r＝0.998 0）。表明各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.4 供試品溶液制備分別精密稱定干燥重樓粉末（過50 目篩）0.25 g，置15 mL 離心管中，精密加甲醇5 mL，稱定質量，混勻，密封，室溫下超聲提取30 min（300 W，40 kHz），取 出，放至室溫，用甲醇補 足減失質 量，10 000 r／min離心8 min，取上清1.5 mL，60 ℃干浴鍋揮干，300 μL 乙腈溶解，經0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

按“2.2”項下方法制備對照品溶液，按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”色譜條件下進樣檢測，得到液相色譜圖。

2.5 不同種及類型對重樓質量的影響 七葉一枝花采自馬關（野生），南重樓采自麻栗坡（野生），五子蓮采自紅河（野生），滇重樓采自紅河（栽培），采回材料清洗干凈，瀝干水分，稱定質量（鮮質量），切片，40 ℃烘干，稱定質量（干質量），打粉，過50 目篩，陰涼低溫處保存。

從圖1 可以看出，不同種重樓液相色譜指紋不一樣，峰也不一樣，只有七葉一枝花和滇重樓含有樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ等4種《中國藥典》規定的皂苷，其他2種重樓皂苷皆不達標。可見不同種間重樓的有效成分含量差異極大，部分成分甚至沒有，所以種的識別應該作為重樓原料質量控制的主要手段。

圖1 不同種重樓液相色譜指紋差異

圖2 混合對照品及樣品對照色譜圖

2.6 不同齡期滇重樓皂苷含量變化 2～7年栽培滇重樓皆為基地育苗移栽，樣品均采自文山市平壩鎮重樓種植基地，3～10年野生滇重樓均采自富寧縣（判斷依據為莖痕），野生及栽培7年生重樓對比材料均采自富寧縣，從圖3～4 可見在對比材料的產地一致、滇重樓種質類型一致，方法一致的情況下，種植滇重樓（2～7年）各皂苷色譜峰面積隨著年限增加都呈上升趨勢，重樓皂苷Ⅰ表現更為明顯，野生滇重樓（3～10年）各皂苷色譜峰面積呈上升趨勢。即在10年生長期內皂苷含量是隨著年限增加而上升，第7年增加最為明顯，7年后1～7種皂苷升高趨勢變緩，而5 和6之間的皂苷峰升高顯著。圖5 栽培和野生滇重樓同種類型、產地相同，液相指紋色譜圖基本一致，總含量差異不明顯，1～3號皂苷栽培重樓偏高，4～7號皂苷是野生重樓偏高。

圖3 2～7年栽培滇重樓皂苷積累動態變化

圖4 3～10年野生滇重樓皂苷積累動態變化

圖5 7年野生與栽培重樓圖譜

2.7 不同收獲時間對滇重樓皂苷的影響 由于生產中藥農主要以收獲的滇重樓根莖鮮質量或者是干質量作為收獲的主要指標，保證不了藥材質量，甚至有的藥農收獲地下部分是根據農事安排，不能保證質量的同時也不能保證收獲量，所以設定一個既能反映干物質收獲量又能反映有效成分的指數作為藥材種植收獲參考指標具有必要性。課題組根據長期調查種植業收獲和實驗測定數據設定了收獲指數，即每克藥材中干燥以后所能收獲的有效成分含量。

材料均采集于文山州文山市平壩鎮，滇重樓3年種苗（野生重樓根莖）來源于滇西北，在平壩鎮已經種植5年，每月25～28 d 采一次材料，每次采樣為5年生滇重樓根莖尾端。設2 次重復。取13 批重樓藥材粉末，進行峰面積測定，計算重樓藥材中7種成分的含量，結果見表1。

表1 顯示，不同收獲時間滇重樓藥材均含有7種皂苷成分。7種皂苷的動態變化，總體基本一致，都呈現2個峰值，集中在6 至9 月和10 至1 月，可見皂苷積累較多主要集中在滇重樓的盛花期和果實成熟期。測定結果表明，滇重樓折干率隨著不同收獲時間變化而變化，9 至12 月折干率均在40%以上，生長量趨于恒定，6～8、11 這4個月皂苷含量較高，收獲指數7 至12 月較高，最高為11 月，11 月份種子已經收獲，根據生產經驗，地下部分生長也基本達到最大，地上部分仍可作為產品利用，故一年之中最適宜收獲的時間為11 月份。

表1 不同收獲期折干率和皂苷含量（mg／g）

2.8 不同產地來源滇重樓皂苷含量差異分別從云南省滇重樓主產地曲靖、景洪、紅河和文山采集滇重樓樣品，文山州廣南、麻栗坡、馬關、西疇、富寧和文山采集滇重樓樣品，年限差距小于2年。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣，得到液相指紋色譜圖6～7。從圖6 可以看出雖然峰面積差異顯著，除景洪外，不同產地滇重樓液相指紋圖譜基本一致；從圖7 可以看出，文山州不同縣市分布滇重樓皂苷指紋圖譜基本一致，含量有所差異，文山和馬關產的滇重樓中峰4 和峰6 明顯比其他幾個產區偏高，但不同成分間峰面積比例基本一致，部分差異由于材料不完全一致影響。可見不同產地滇重樓皂苷含量差異顯著，目前暫未找到變化規律，景洪樣品為市場上購買根莖，類型、亞種上不能準確鑒定。

圖6 云南省不同地區滇重樓HPLC 指紋圖譜

圖7 文山州不同產區滇重樓HPLC 指紋圖譜

3 討論

黃偉光等［11］采用J.W.Rothiock 等氏方法水解提取了重樓薯蕷皂素。近年來，研究人員對滇重樓主要皂苷含量的進行了不同方法的測定分析，并與近源種進行了對比研究［7，12?14］不同產地滇重樓皂苷含量，其品質受產地、環境因素影響較大，表現出一定的地域性及生境依賴性［15］，滇重樓生長年限不同，收獲期不同，其皂苷含量也有較大差異，1～7年生重樓隨年齡增加基本呈上升趨勢［16?20］。HPLC在中藥化學成分分析方面應用較多，采用HPLC 對滇重樓皂苷進行檢測分析簡便、準確，具有良好的精密度、重復性、穩定性，可用于滇重樓的質量控制及綜合評價［12?23］。

不同種及亞種間皂苷含量有顯著差異，目前研究結果表明含有重樓皂苷Ⅰ、重樓皂苷Ⅱ、重樓皂苷Ⅵ、重樓皂苷Ⅶ的重樓有七葉一枝花，滇重樓［7］，本實驗中的七葉一枝花和滇重樓液相色譜圖也都包含了這4種皂苷的4個主要色譜峰。不同產地重樓的有效成分含量存在明顯差異［15］；尹顯梅等［20］同時測定華重樓6種皂苷，認為最佳種植年限為8年、最佳采收季節為11 月份。趙廷周等、夏從龍等［18?19］也對滇重樓收獲期進行了研究，但是結果不一。本實驗結果表明了隨著時間的變化總皂苷變化的規律與重樓的發芽、開花、結實等有一定關系。滇重樓皂苷含量是衡量滇重樓質量的主要指標之一，重樓除了2015年版《中國藥典》 中規定的4種主要皂苷外，重樓皂苷V、重樓皂苷H、薯蕷皂苷等也是滇重樓中的主要皂苷，且含量較高，同樣具有鎮痛、止血、抗腫瘤等功效，所以本實驗中主要以這7種皂苷作為重樓的主要考察指標，結合折干率，設定了收獲指數。

不同種決定了重樓皂苷的種類和多少，種的鑒別和限定應該作為市場流通中控制質量的主要手段，液相指紋圖譜、薄層、及新鮮根莖外觀均可作為鑒定手段；隨著栽培年限的增加，滇重樓皂苷含量成上升趨勢，7年以后含量增加趨于平緩，建議滇重樓種植7年以后收獲；收獲時間對皂苷含量影響明顯，干物質的積累量影響藥農的經濟收成，同時通過近幾年來的栽培經驗，11 月份以后滇重樓地下部分基本達到一年中最大產量，故11 月為最佳收獲期，收獲指數則把兩者關聯起來，通過收獲指數測定確定藥材的收獲時間11 月份為最佳，產地對重樓皂苷含量的影響顯著，推測可能與海拔和種質的鑒定有一定關系，重樓應該有種植區域的限定和朔源體系；栽培模式對滇重樓皂苷含量的也有一定影響，但不顯著。本實驗中提出了收獲指數的定義，并作為確定滇重樓收獲期的主要參考指數，本指標既反應了滇重樓收獲的干物質量同時也反應了滇重樓的皂苷含量。

致謝：本實驗在開展過程中得到了中科院昆明植物所李恒研究員的指導，特此謝意！