阿奇霉素合用穿心蓮內酯對感染性肺炎協同影響

袁曉燕徐文豪 金 典 母育成 諶立巍 陳彥清*

（1.攀枝花市中心醫院，四川 攀枝花617067； 2.成都中醫藥大學藥學院，四川 成都611137）

感染源性肺炎是臨床常見病，多發病［1］。抗感染治療是臨床最為主要的治療思路［2］。由于我國獨特的中醫藥資源，國內臨床實踐中也常合用以清熱解毒為代表的各類中藥制劑。多年的臨床實踐也證實中西藥合用可顯著改善患者的一些體感癥狀，縮短損傷性反應持續時間，最終有助于提高治愈率和治愈速度［3］。

藥物合用具有極其復雜的表征，其合理性除從臨床觀察性資料匯總以評價外，近年來使用定量藥理學手段結合實驗藥理學方法，量化得出的相關結論也可精確區分合用對療效的改善類型，并能指出其相關聯的作用機制。合用后，理論認為藥動學和藥效學均可影響療效。本研究對臨床治療感染性肺炎的常見中西藥合用阿奇霉素聯合穿心蓮內酯［4?5］采用微分量效方程的方法，從藥效學的角度闡述其合用的臨床機制。

1 材料

1.1 受試藥物 穿心蓮內酯對照品（成都埃法生物科技有限公司，批號AF8072353，純度＞99%）；阿奇霉素對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號810A031，純度＞99%）。

1.2 儀器 全自動細菌分析儀（Vitek 2compact，法國生物梅里埃公司）；液相芯片儀（MAGPX12157001，美國Luminex 公司）；生物安全柜（1300，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；導尿管（14，揚州市桂龍醫療器械有限公司）；麥氏比濁儀（DEN?1，英國Grant Instruments 公司）；細胞因子多指標液相芯片（RECYTMAG?65 K?07，美國Merck Millipore 公司）；非線性混合效應群體藥效藥動計算軟件Monolix（version 2019R2，法國Lixoft 公司）。

1.3 菌株 2018年12 月于攀枝花中心醫院住院患者呼吸道送檢痰液中分離，經全自動細菌分析儀鑒定為肺炎克雷伯菌Klebsiella Pneumoniae，紙片保存法保存于－80 ℃。試驗前2 天，將含菌紙片緊密貼于無菌LB 瓊脂培養基平板，37 ℃電熱恒溫培養箱中孵育18 h 以上。用無菌接種環圈選擇單一并長勢良好的菌團，均勻涂抹于新鮮LB 培養基平板，相同條件繼續孵育18 h，得到足量、純化的受試菌，備用。

1.4 動物 SD 大鼠，雄性，SPF 級，180～200 g，購于重慶恩斯維爾生物科技有限公司，動物生產許可證號SCXK（川）2018?0003，飼養于成都中醫藥大學藥學院IVC 動物飼養實驗室，恒溫恒濕［（25±1）℃，80%］。

1.5 試劑 水解酪蛋白肉湯培養基（Mueller?Hinton，MH培養基，批號20171026）、普通肉湯培養基（Luria?Bertani Broth，LB 培養基，批號20190129）、胰蛋白胨大豆肉湯培養基（Tryptone Soy Broth，TSB 培養基，批號20190726）均購自青島海博生物技術有限公司；烏來糖（批號20190726，成都市科龍化工試劑廠）。

2 方法

2.1 細菌感染性肺炎模型的構建 模型構建參考文獻［6?7］。受試大鼠，隨機分為空白組、模型組、穿心蓮內酯組、阿奇霉素組、穿心蓮內酯聯合阿奇霉素低、中、高劑量組，共7組。將純化后增毒肺炎克雷伯菌溶于2 mL 生理鹽水中，振蕩至完全分散，配置成終濃度為0.5 麥氏濃度（1×108CFU／mL）的懸液，并經麥氏比濁儀比濁確定。除空白組，其余動物20%烏來糖水溶液腹腔注射麻醉后，經氣管導管注入配置好的細菌液400 μL（1×108CFU／mL），輕輕晃動大鼠身體確保菌液均勻分散至兩側肺部。同時觀察呼吸以及心臟跳動情況，待大鼠蘇醒并能活動后，裝箱，將大鼠放回至IVC 獨立換氣籠中飼養。造模當天計為0 d，連續觀察3 d，以大鼠出現寒顫、抓耳撓鼻、毛發浸濕，部分出現鼻腔、眼角出血為指征，提示造模成功。全程檢測大鼠體質量和飲水飲食情況。最終，各造模組選取6 只感染性肺炎大鼠進入下一階段實驗。以上所有實驗過程均嚴格按照國家《實驗動物管理條例》 及《關于善待實驗動物的指導性意見》 進行，并盡一切努力將動物的不適和痛苦降至最低。

2.2 給藥 除空白組與模型組外，其余各組大鼠第3 天開始連續3 d 每日灌胃給藥一次。劑量分組為穿心蓮內酯組（40.5 mg／kg）、阿奇霉素組（4.5 mg／kg）、40.5 mg／kg 穿心蓮內酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯用高劑量組）、20.25 mg／kg穿心蓮內酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯用中劑量組）、10.125 mg／kg 穿心蓮內酯＋4.5 mg／kg 阿奇霉素（聯用低劑量組）。

2.3 樣本采集及檢測 給藥當天開始，每天中午10 時各組大鼠尾靜脈采血，分離血清；于第6 天處死大鼠，取肺組織，用福爾馬林固定，HE 染色后，行鏡下病理檢測。所有血清樣本采用液相芯片檢測IL?1β、IL?4、IL?6、TNF?α、IFNγ、IL?10、IL?17A 水平。

2.4 量效微分方程模型建立 近年來定量藥理學對經典量效方程中療效作用的評價從單時間點發展為治療階段的全過程檢測，從而引入動力學處理的研究思路，可定量評價劑量?全療程療效的復雜情況［8］。同時，這一方法對聯用藥物合用結果的判定也具有較高的分辨能力［9］。參考以上方法，對不同劑量穿心蓮內酯與固定劑量的阿奇霉素給藥后建立了如下的量效關系微分動力學系統。

采用零級動力學描述細菌感染后大鼠血清中細胞因子生成，采用一級動力學描述細胞因子的消除，則細胞因子的經時變化，＝k－ ke×R 式中R 代表細胞因子水平，dR／dT 代表造模后細胞因子的變化率；k 為零級生成率，ke細胞因子的一級消除速度；單獨使用阿奇霉素對細胞因子變化的抑制效應（Azm），采用經典抑制描述，＝k×（1?Azm）?ke × R；單獨使用穿心蓮內酯對細胞因子變化的抑制效應（Andr）微分方程，＝k×（1－Andr）?ke×R；穿心蓮內酯與阿奇霉素合用后對細胞因子變化的抑制效應（Azm），如具有級聯作用微分方程，＝k×（1－Azm）×（1?Andr）?ke×R；如符合加和作用即采用的微分方程，＝k×（1?Azm?Andr）?ke×R；以上加和作用具有交互作用即采用的微分方程，＝k×（1?Azm?Andr?Azm×Andr）?ke×R。基于藥物效應動力學理論，Andr 和Azm 可采用線性、對數線性、Emax以及Sigmod Emax不同的PD 模型擬合。

由于本實驗用液相芯片法同時測定了7種細胞因子的水平，如所有細胞因子數據全部用于全模型比較和參數擬合，計算壓力和時長均較大，也容易出現過擬合現象。因此，我們對全部個體所有時間點測定的細胞因子首先進行相關性分析，采用R3.11 中基礎包的scatterplot 函數進行進入最終量效微分動力學參數擬合藥效數據的篩選。確定藥效指標后，所有個體的劑量?時間?細胞因子含量模型參數擬合按以上微分方程以非線性混合效應算法求解，模型中個體參數均假定服從對數正態分布，誤差模型均采用線性比例模型。低于定量限的濃度點在擬合時標注為LLQ，于擬合時采用半定量已知加以處理。以?2 對數似然值（?2LL）、最小化信息量（AIC）、貝葉斯信息準則（BIC）、模型間Fisher 檢驗為主要擬合優度參數的標準，選擇擬合優度最高的模型報道相關參數。所有組別，含空白（劑量數據設定為0）、模型（劑量數據設定為0）、阿奇霉素、穿心蓮內酯、阿奇霉素聯合穿心蓮內酯各劑量組，所有個體數據采用一步法方法計算。

2.5 統計分析 實驗數據采用SPSS 21.0 for windows 軟件進行處理，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05 為差異統計學意義。

3 結果

3.1 一般藥理學指標 造模及給藥后，各組大鼠觀測期間的體質量及飲水、飲食變化如圖1 所示。結果表明感染后的各組大鼠均出現體質量、飲食和飲水量下降；模型組體質量在造模后呈連續下降趨勢，其余5組大鼠在造模后第3 天即開始給藥后體質量和飲水、飲食量呈上升趨勢。聯合用藥的3組大鼠在給藥后與空白組基本生理狀態較為接近。

圖1 各組大鼠實驗時程中體質量、飲食和飲水量變化（n＝6）

3.2 肺組織的病理檢測 典型病理照片如下圖2 所示，空白組動物肺組織各級支氣管及肺泡組織結構均正常，未見明顯組織病理學損傷。模型組動物肺組織結構消失，大量中性粒細胞浸潤并填充整個肺泡腔及各級支氣管，壞死崩解的中性粒細胞形成膿汁蓄積整個肺臟組織，呈典型的化膿性肺炎狀態。各給藥組相對模型組病理損傷均有顯著改善，但給藥組之間的統計無統計學差異。

圖2 各組大鼠給藥3 d 后的肺部病理HE 染色圖（HE×40）

3.3 血清中炎癥因子水平 從圖3 可見，造模后檢測的7種細胞因子均升高，但隨著模型動物的自我恢復，其數值出現明顯的回復，因此從任一時間點評價藥物的療效強度均有不妥，這一現象采用含時間變量的動力學方程加以描述是系統性評價的良好手段。從圖4 可見，IL?4、IL?6 和TNF?α 呈明顯線性同步趨勢，IL?1β 和IL?10 也呈現出較明顯的線性趨勢。提示以下步驟的動力學建模可以精簡相關指標后進行。結合圖3～4，考慮指標變化明顯、劑量?效應梯度顯著，最終選擇IL?4 和IL?17 A 作為最終量效微分方程的藥效學指標。

圖3 觀測時間段內各組大鼠各細胞因子時程圖（n＝6）

圖4 炎癥因子的相關性評價圖

3.4 量效微分方程評價藥物合用原理 采用非線性混合效應群體方法計算，模型竟爭結果表明兩種藥物作用函數均為Emax×Dose／（IC50＋Dose），即Emax型；合用組作用機制以加和性擬合較優。最終以IL?4 和IL?17A 為藥效指標，一步求解所有個體時間、各藥物劑量的量效微分方程組。最終模型擬合值與實測值比較圖如圖5 所示，表明采用的最終模型以較高的優度表征了兩者合用對炎癥因子抑制的合用機制，即合用以兩者作用的相加為主，不具有級聯放大作用，也不具有相互的交互影響。擬合參數如表1 所示。從表1 可見，對于IL?4 和IL?7 兩炎癥指標，穿心蓮內酯的Emax值均大于阿奇霉素Emax值，提示穿心蓮內酯效能優于阿奇霉素，特別是抑制IL?4 生成的作用；但是穿心蓮內酯的IC50均大于5 mg／kg，說明藥物要較大劑量時才能發揮最大效應，因此效價強度較差。

表1 量效微分方程模型擬合的穿心蓮內酯和阿奇霉素合用對IL?4 和IL?17A 的效應參數表（， n＝6）

表1 量效微分方程模型擬合的穿心蓮內酯和阿奇霉素合用對IL?4 和IL?17A 的效應參數表（， n＝6）

圖5 量效微分方程擬合優度圖

4 討論

感染性肺炎已成為影響社會秩序的重大疾病，不論何種感染源，由于呼吸道的開放性和自身定殖菌的存在，幾乎所有的患者疾病進展中均會合并一定的細菌感染。阿奇霉素由于其廣譜、高效、良好的藥物動力學性質和極好的安全性，已成為肺炎相關病的重要用藥之一。近年來，除直接的抗菌作用外，阿奇霉素也被證實具有一定的抗炎作用［10］。其直接抗菌而間接降低炎癥的刺激源，同時抑制STAT1 和NF?κB 等炎癥通路，降低相應的炎癥因子產生和分泌，避免機體出現嚴重的細胞因子風暴［11］。當肺部受到細菌侵襲時，機體全面啟動免疫應答，誘發炎癥。在炎癥反應的早期階段，TNF?α 是最早出現且最重要的炎癥因子，可進一步激活免疫細胞［12］；單核細胞和巨噬細胞合成IL?1β 介導外周循環的炎癥因子在肺泡和肺間質聚集，加重炎癥反應［13］；IFN?γ 可增強免疫細胞活性［14］；IL?4、IL?6、IL?10 發揮免疫刺激效應，是反映肺部感染及疾病嚴重程度的重要參考指標［15?17］。在此過程中，Th17細胞分泌的IL?17A 在中性粒細胞的增殖、成熟和趨化作用中扮演了重要角色，并與肺炎感染嚴重程度呈正相關［18］。

本研究結果顯示，單獨使用阿奇霉素可降低INF?γ、IL?10 和IL?17A 給藥時程的整體濃度。在阿奇霉素給藥中段TNF?α、IL?4、IL?6 的濃度具有反彈現象，這可能與其殺菌后死亡菌體刺激體內免疫反應，并強于其直接抗炎反應有關。合并使用穿心蓮內酯后這一現象得到了極大緩解。既往研究表明穿心蓮抗菌作用較差，但對炎癥等體細胞反應在較低劑量時仍具有極強的抑制作用［19］。因此，抗菌藥物與穿心蓮內酯合用對感染性肺炎可能是雙作用的整合，即抗菌藥物發揮對抗感染源，降低肺部病原微生物數量，而穿心蓮內酯作用于感染引起的機體炎癥與免疫環節，減輕病理損傷，整體性地改善了患者的臨床表現。本研究表明，引入穿心蓮內酯可顯著增加對相關炎癥因子的分泌抑制，這一作用符合加和原理，即合用雖不產生級聯放大的增效作用，但也沒有影響療效的交互影響。

同時，本研究表明穿心蓮內酯與阿奇霉素的作用強度存在顯著區別。對IL?4，穿心蓮內酯的價效約為阿奇霉素的200 倍。但兩者針對IL?17 A 的作用強度相似。模型揭示穿心蓮內酯的IC50較大，效價強度較低，具有低效價高效應的作用特點。這也說明了穿心蓮內酯在保證足夠的給藥量或改善相關生物利用度后，其最終作用仍較為明顯。提示中藥應用時，相關量效的研究具有重要的臨床指導價值，基于量效微分藥效動力學的群體建模與參數擬合可以較準確的獲取具有參考意義的相關參數，可作為一個判斷藥物聯用合理性的一個重要應用方法加以深入探索。