丹酚酸B 抑制波動高糖誘導的糖尿病大鼠心肌細胞凋亡

趙夢秋 任尤楠 陶善珺 鄭書國*

（1.安徽衛生健康職業學院藥學教研室，安徽 池州247009； 2.皖南醫學院藥理教研室，安徽 蕪湖241002）

糖尿病及其心血管并發癥的發病率和致死率近年來持續上升，是威脅人類健康的一大殺手［1］。糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的一種嚴重的心血管并發癥，疾病早期就能觀察到結構與功能障礙［2］，心肌細胞凋亡是其主要的病理特征之一。DCM 的發病機制尚未完全闡明，多種因素如高血糖、胰島素抵抗、代謝紊亂等可通過氧化應激、內質網應激、鈣調節受損、線粒體功能障礙等各種途徑促使心肌細胞凋亡［3］，其中高血糖發揮關鍵作用。此外，血糖波動可能是糖尿病患者早期心功能異常的危險因素［4］，血糖波動可引起比持續高糖更嚴重的慢性并發癥，如心肌細胞產生氧化應激損傷，使心肌細胞凋亡增加［5］。

作為傳統中藥丹參中提取出來的一種活性化合物，丹酚酸B 的心臟保護作用在多種模型上得到驗證［6?7］。然而丹酚酸B 是否能夠減輕波動高血糖造成的心臟損傷，延緩DCM 進程尚不清楚。本實驗在糖尿病大鼠模型上通過人工干預造成一日內血糖水平大幅波動，并觀察丹酚酸B 對心肌細胞凋亡的影響。

1 材料

1.1 動物與飼料 雄性SD 大鼠，體質量220～240 g，購于浙江省實驗動物中心，實驗動物生產許可證號SCXK（浙）2014?0001；高糖高脂飼料（含豬油10%、蔗 糖10%、蛋黃粉5%、膽固醇1%、普通飼料74%），購于南京市青龍山實驗動物中心。

1.2 藥物與試劑 丹酚酸B（純度80%，HK201410），購于西安文竹生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（STZ，1126C028），購于美國 Sigma 公 司；普通胰島素（2141D2D9），購于江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司；Bcl?2一抗（AF6139）、Bax 一抗（AF0120），購于上海玉博生物科技有限公司；β?actin 抗體（ab8226）購于英國Abcam 公司；二抗（DXWB048）、蛋白定量試劑盒（DXWB010）購于上海代軒生物科技有限公司；天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶（caspase）3 檢測試劑盒（CK?E30186R）、磷酸肌酸激酶（CK?MB）試劑盒（CK?E90320R）購于蘇州卡爾文生物科技有限公司；TUNEL 檢測試劑盒（11684817910）購于瑞士羅氏公司；其余試劑均為分析純。

1.3 儀器 血糖儀購于長沙三諾生物傳感技術有限公司；全功能發光儀器購于上海復日科技有限公司；酶標儀購于北京普朗新技術有限公司；高速離心機購于杭州奧盛儀器有限公司；電泳儀、轉膜儀購于北京六一儀器廠；熒光顯微鏡購于日本尼康公司。

2 方法

2.1 糖尿病大鼠血糖波動模型制備與給藥 適應性喂養1周后，隨機選取10 只大鼠作正常組，喂以普通飼料，其余大鼠給予高糖高脂飼料。4 周后，禁食12 h，按40 mg／kg一次性腹腔注射STZ 制備糖尿病模型。繼續喂養7 d 后以隨機血糖≥16.7 mmol／L 為模型制備成功。將糖尿病大鼠隨機分為模型組、丹酚酸B 高劑量組及丹酚酸B 低劑量組。模型組和丹酚酸B 給藥組繼續喂飼高脂飼料，于每日8∶00 及18∶00 檢測血糖值，并根據血糖水平，選擇皮下注射普通胰島素6～9 U（隨機血糖≥16.7 mmol／L）或灌胃給予葡萄糖2 g／kg（隨機血糖＜16.7 mmol／L），造成1 日內血糖水平大幅度波動模型［8］。丹酚酸B 給藥組同時灌胃給予丹酚酸B 160 mg／kg 和80 mg／kg，連續6 周。

2.2 大鼠空腹血糖及血糖波動水平檢測 參考文獻［9］。實驗結束前檢測一日內各組大鼠8：00、12：00、16：00、18：00 和20：00 血糖值計算最大血糖波動幅度（LAGE），禁食12 h 后測定空腹血糖。

2.3 心肌細胞凋亡檢測 實驗結束后，戊巴比妥鈉（30 mg／kg）麻醉，腹主動脈取血，取出心臟。取相同部位心肌組織常規石蠟包埋、切片，EDTA 抗原修復緩沖液微波抗原修復，10%兔血清封閉后按TUNEL 試劑盒要求加入凋亡檢測反應液，DAPI 染液復染細胞核，抗熒光淬滅封片劑封片。切片于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。

2.4 生化指標檢測分離血清，按試劑盒說明書檢測大鼠CK?MB 水平。取心肌組織制備10%組織勻漿，按試劑盒說明書測定caspase?3，BCA 法測定蛋白濃度。

2.5 心肌組織Bcl?2、Bax 蛋白表達檢測 RIPA 裂解液提取心肌組織總蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜、封閉后依次加入一抗及二抗孵育，ECL 顯色，全功能發光儀檢測分析結果。以與內參蛋白光密度的比值作為蛋白的相對表達量。

2.6 統計學分析 采用DAS 1.0 統計軟件進行分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK?q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 丹酚酸B 對大鼠空腹血糖和最大血糖波動幅度的影響 由表1 可見，模型組大鼠空腹血糖及最大血糖波動幅度較正常組大鼠均升高（P＜0.01），表明糖尿病血糖波動模型造模成功。丹酚酸B 給藥組大鼠空腹血糖比模型組大鼠降低（P＜0.05，P＜0.01），但對血糖波動無明顯影響。

表1 丹酚酸B 對大鼠空腹血糖及最大血糖波動幅度的影響（， n＝7）

表1 丹酚酸B 對大鼠空腹血糖及最大血糖波動幅度的影響（， n＝7）

注：與正常組比較，** P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 丹酚酸B 對糖尿病大鼠心肌細胞凋亡的影響圖1 為TUNEL 法檢測各組大鼠心肌細胞凋亡圖片。DAPI 染色細胞核，顯示藍色熒光，FICT 顯示綠色熒光，該熒光提示細胞凋亡。圖片顯示正常組大鼠心肌細胞凋亡極少，糖尿病大鼠心肌細胞凋亡數量最多，丹酚酸B 給藥組大鼠心肌細胞凋亡減少。

圖1 丹酚酸BP 對大鼠心肌細胞凋亡的影響（TUNEL， ×200）

3.3 丹酚酸B 對糖尿病大鼠血清CK?MB 水平影響 如圖2 所示，糖尿病大鼠血清CK?MB 水平較正常組升高（P＜0.01），說明波動高糖造成了糖尿病大鼠心肌細胞損傷。丹酚酸B 給藥組血清CK?MB 水平降低（P＜0.01），提示丹酚酸B 可減輕糖尿病大鼠心肌細胞損傷。

圖2 丹酚酸B 對大鼠血清CK?MB 水平的影響（n＝7）

3.4 丹酚酸B 對糖尿病大鼠心肌組織caspase?3 表達的影響 糖尿病大鼠心肌組織caspase?3 表達比正常組升高（P＜0.01），而丹酚酸B 給藥后上述指標降低（P＜0.01），見圖3。

圖3 丹酚酸B 對大鼠心肌組織caspase?3 水平的影響（n＝7）

3.5 丹酚酸B 對糖尿病大鼠心肌組織Bcl?2、Bax 蛋白表達的影響 如圖4 所示，糖尿病大鼠心肌組織Bcl?2 蛋白表達比正常組減少，而Bax 蛋白表達增加（P＜0.05，P＜0.01），丹酚酸B 給藥能夠改善這種趨勢（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 丹酚酸B 對大鼠心肌組織Bcl?2 及Bax蛋白表達的影響（n＝3）

4 討論

心肌細胞凋亡是DCM 主要病理特征之一。臨床研究發現在DCM 發病過程中，心肌細胞凋亡和心功能不全相互促進，最終發展為心力衰竭。心肌細胞異常凋亡數量增加，可導致心肌有效收縮單元不斷減少，從而影響心臟功能。而心功能不全造成心臟射血功能降低，導致心肌缺血缺氧，進一步加劇心臟神經?內分泌功能失調，促進心肌細胞凋亡的發生［10］。因此，抑制心肌細胞凋亡是延緩DCM 的重要手段之一。本實驗中，課題組在糖尿病大鼠模型上構建了血糖波動模型，并觀察到模型組大鼠心肌細胞凋亡增加，同時血清CK?MB 水平升高，這與文獻報道一致［11?13］。丹酚酸B 給藥組大鼠心肌凋亡數量及血清CK?MB 水平均降低，提示丹酚酸B 對波動高糖誘導的糖尿病大鼠心肌細胞凋亡有改善作用。

DCM 心肌細胞凋亡發生機制較為復雜，高血糖、高血脂、氧化應激損傷以及炎癥反應都是引起心肌細胞凋亡的重要原因。在眾多參與凋亡調控的基因中，Bcl?2 家族是一種重要的調控因子［14］。Bcl?2 和Bax 在凋亡過程中發揮的功能是對立的，Bcl?2 作為抗凋亡因子，其同源二聚體有助于維持線粒體的穩態，而Bax 則發揮著促凋亡的作用。當細胞受到外界刺激時，Bcl?2 與Bax 的比值降低，Bcl?2 對Bax 的抑制作用減弱，Bax 通過寡聚化插入到線粒體外膜，造成線粒體膜通透性增加［15］，從而促發凋亡。caspase 是一種促使細胞凋亡的酶，在細胞凋亡中發揮重要作用。caspase 級聯反應能被包括Bcl 家族在內的多種凋亡信號調控。caspase?3 是細胞凋亡過程中的終末剪切酶，是細胞凋亡的有力執行者，可通過催化細胞基質裂解，加速細胞凋亡。本實驗觀察到波動高血糖誘導大鼠心肌細胞凋亡增加的同時，Bcl?2 蛋白表達減少，Bax 與caspase?3 表達增加，而丹酚酸B 給藥能夠上調Bcl?2 的表達，抑制Bax 與caspase?3 表達，減少心肌細胞凋亡。上述結果提示丹酚酸B 對心肌的保護作用可能與增加Bcl?2 的表達、抑制Bax 與caspase?3 表達有關。

綜上所述，丹酚酸B 可能通過調節Bcl?2 與Bax 表達抑制波動高糖誘導的大鼠心肌細胞凋亡。