益氣養陰解毒方及黃芪甲苷體外對CTLA?4 介導的肺癌免疫逃逸的影響

姜 怡 蔡雨晴 張 朋沈麗萍劉苓霜*劉嘉湘

（1.上海中醫藥大學附屬龍華醫院，上海200032； 2.上海中醫藥大學研究生院，上海200120）

在我國，肺癌發病率和死亡率均居惡性腫瘤首位［1］，嚴重危害人類健康。忽視機體免疫系統在肺癌發生發展中的重要作用是阻礙臨床療效提高的重要原因之一。細胞毒T 淋巴細胞相關抗原4（cytotoxic T lymphocyte?associated antigen?4，CTLA?4）是介導腫瘤免疫逃逸的重要抑制性分子，主要表達在活化的CD4＋和CD8＋T細胞表面，組成性地表達于調節性T細胞（regulatory T cell，Treg）表面，與CD28 競爭性地結合抗原提呈細胞表面的B7分子發揮免疫抑制作用，且CTLA?4 與B7分子的親和力高于CD28［2?3］。可溶性CTLA?4（soluble CTLA?4，sCTLA?4）存在于外周循環中，與淋巴細胞表面的膜型CTLA?4（membrane?bound CTLA?4，mCTLA?4）具有相同的生物學效應。

國醫大師劉嘉湘教授創立的“扶正治癌”學術思想指導肺癌治療取得了顯著的臨床療效，其作用機制與免疫調節密切相關［4］。益氣養陰解毒方是“扶正法”治療肺癌的代表方，全方益氣養陰以扶正固表，清熱解毒標本兼顧。作者課題組前期研究發現，益氣養陰解毒方及其類方可以提高肺癌患者生活質量、穩定瘤灶和延長生存期，作用機制與改善外周細胞免疫功能、下調sCTLA?4 表達相關［5?7］。黃芪是益氣養陰解毒方的君藥，補益肺脾之氣。黃芪甲苷是黃芪最主要的單體活性成分［8］，具有抗肺癌的活性，其機制可能與抑制吲哚胺?2，3?雙加氧酶（Indoleamine 2，3?dioxygenase，IDO）表達，進而下調Treg細胞水平，增強細胞毒性T 淋巴細胞的活性有關［9］。益氣養陰解毒方及黃芪甲苷體現了中醫“扶正法”提高自身抗癌能力的治療理念。基于此，本研究并非觀察中醫藥對腫瘤細胞的直接抑制作用，而是應用淋巴細胞與腫瘤細胞共培養體系，探討益氣養陰解毒方及黃芪甲苷通過下調mCTLA?4 及sCTLA?4表達，逆轉CTLA?4 介導的肺癌免疫逃逸，進而抑制腫瘤的生長，并探索中醫藥聯合CTLA?4 阻斷劑的應用價值。

1 材料

1.1 動物和細胞 C57BL／6 小鼠，6～8 周齡，雄性，體質量約20 g，購自上海西普爾?必凱實驗動物有限公司，實驗動物生產許可證號SCXK（滬）2018?0006。小鼠Lewis 肺癌細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。

1.2 藥物與試劑 益氣養陰解毒方由生黃芪30 g、北沙參30 g、天冬15 g、麥冬15 g、女貞子12 g、山茱萸9 g、絞股藍15 g、仙靈脾15 g、葫蘆巴12 g、石上柏30 g、石見穿30 g、重樓15 g組成，生藥由上海中醫藥大學附屬龍華醫院中藥房提供。益氣養陰解毒方按傳統方法制成水煎劑，旋轉蒸發儀濃縮后制成凍干粉，凍干粉由上海中醫藥大學附屬龍華醫院科技中心實驗室制備，使用真空干燥（60 ℃）。益氣養陰解毒方凍干粉采用PBS 溶解，制備成質量濃度為50 mg／mL 的貯備液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后分裝，4 ℃保存備用。黃芪甲苷（北京索萊寶科技有限公司，SA8640）粉末，純度≥98%（HPLC），用DMSO制備成質量濃度為20 mg／mL 的母液，－20 ℃保存備用。抗小鼠CTLA?4 單抗［clone 9H10］ （美國BioXCell 公司，660518J1），質量濃度為7.32 mg／mL，以PBS 作為溶劑，4 ℃避光保存備用。小鼠脾臟淋巴細胞分離液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，P8860）。APC 標記的抗小鼠CD152（CTLA?4）單克隆抗 體（美 國Biolegend 公 司，106310）。FITC 標記的抗小鼠CD8a 抗體（美國Biolegend公司，100705）。小鼠CTLA?4 ELISA 試劑盒（英國Abcam公司，ab255720）。細胞計數試劑盒?8（CCK?8）（上海碧云天生物技術有限公司，C0037）。

1.3 儀器 CO2培養箱（美國賽默飛世爾科技公司，51020241）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，OLYMPAS IX71）；臺式低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，L500）；多功能酶標儀（美國MD 公司，SpectraMax M2e）；流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特公司，FACS Calibur）。

2 方法

2.1 細胞培養 取培養基RPMI 1640，加10% FBS 和1%雙抗（100 U／mL 青霉素及100 U／mL 鏈霉素），將消化后的Lewis 肺癌細胞與配置好的培養基在37 ℃、5%CO2培養箱中培養。取對數生長期的Lewis 肺癌細胞用于后續實驗。

2.2 小鼠脾臟淋巴細胞分離 無菌條件下摘取C57BL／6小鼠脾臟，撕去脾臟被膜，用眼科剪將脾臟剪成小塊。將200 目尼龍篩網放置于平皿上，加入少量組織稀釋液，將脾臟放置于篩網上，使用注射器活塞來研磨脾臟。研磨完全后使用組織稀釋液沖洗篩網，收集細胞懸液，再經濾網過濾。加入與脾臟單細胞懸液等量的分離液。吸取單細胞懸液加于分離液液面上。室溫，2 500 r／min，離心25 min。用移液槍吸取第二層環狀乳白色淋巴細胞至另一潔凈的15 mL離心管中，向離心管中加入10 mL細胞洗滌液洗滌白膜層細胞，1 000 r／min，離心10 min。棄上清，5 mL 的細胞清洗液重懸細胞，1 000 r／min，離心10 min，并重復一遍。棄上清，細胞重懸備用。

2.3 小鼠脾臟淋巴細胞與Lewis 肺癌細胞共培養體系及分組給藥 將對數生長期Lewis 肺癌細胞和小鼠脾臟淋巴細胞進行細胞接觸式共培養，共培養時間為24 h。分為空白對照組、黃芪甲苷組（單體組）、益氣養陰解毒方組（復方組）、抗CTLA?4 單抗組（單抗組）、黃芪甲苷＋抗CTLA?4 單抗組（單體＋單抗組）、益氣養陰解毒方＋抗CTLA?4 單抗組（復方＋單抗組）。本研究預實驗采用CCK?8 法檢測益氣養陰解毒方和黃芪甲苷對Lewis 肺癌細胞存活率的影響以選擇合適的給藥濃度，結果顯示益氣養陰解毒方給藥濃度1 000 μg／mL、黃芪甲苷給藥濃度80 μg／mL 以下對Lewis肺癌細胞生長無影響，并參考抗CTLA?4 單抗促進IL?2 和INF?γ分泌、增強免疫功能的體外研究［10］，本實驗益氣養陰解毒方、黃芪甲苷及抗CTLA?4 單抗的給藥濃度分別為500、50、5 μg／mL。

2.4 流式細胞術檢測mCTLA?4 及CD8＋T細胞的表達 將對數生長期的Lewis 肺癌細胞（1×106／mL）接種于6 孔板中，每孔1 mL，每組3 復孔，待腫瘤細胞貼壁后，加入小鼠脾臟淋巴細胞（1×106／mL），每孔1 mL，根據組別加入益氣養陰解毒方（500 μg／mL）、黃芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA?4 單抗（5 μg／mL），共培養24 h。從共培養體系中吸取懸浮的淋巴細胞，PBS 清洗2 次后，加入CD8、CTLA?4 抗體，避光孵育30 min。PBS 清洗，加入300 μL PBS 重懸細胞，流式細胞儀上機檢測CD8＋T細胞和mCTLA?4。

2.5 ELISA 檢測sCTLA?4 共培養體系同“2.4”，取共培養所得上清，嚴格按照小鼠CTLA?4 ELISA 試劑盒說明書進行操作。根據試劑盒中提供的標準品濃度繪制標準曲線，計算其質量濃度，單位用pg／mL 表示。

2.6 CCK?8 檢測Lewis 肺癌細胞的增殖情況 在96 孔板里，每孔加入Lewis 肺癌細胞（2 000個細胞）在含10%FBS 的RPMI 1640 培養液中進行培養，待腫瘤細胞貼壁后，加入小鼠脾臟淋巴細胞（2 000個細胞），根據組別加入益氣養陰解毒方（500 μg／mL）、黃芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA?4 單抗（5 μg／mL），每孔終體積為100 μL，每組3個復孔，共培養24 h，棄去培養上清（包括淋巴細胞），PBS 清洗1 次后每孔加入10 μL CCK?8 溶液和90 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培養液，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱內繼續孵育4 h，在450 nm 測定吸光度值。計算細胞存活率，存活率＝（OD實驗組／OD對照組）×100%。

2.7 統計學分析 采用SPSS 20.0 軟件進行數據分析，實驗數據以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。運用GraphPad Prism 5 軟件進行作圖。

3 結果

3.1 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對mCTLA?4 及CD8＋T細胞的影響 與空白對照組比較，單體組、復方組、單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組mCTLA?4 表達降低（P＜0.01）；與單體組比較，單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組mCTLA?4 表達降低（P＜0.01）；與復方組比較，單體＋單抗組和復方＋單抗組mCTLA?4 表達降低（P＜0.05）；與單抗組比較，復方＋單抗組mCTLA?4 表達降低（P＜0.01）。與空白對照組比較，單體組、復方組、單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組CD8＋T細胞表達升高（P＜0.05）；與單體組比較，單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組CD8＋T細胞表達升高（P＜0.01）；與復方組比較，復方＋單抗組CD8＋T細胞比例升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對mCTLA?4 和CD8＋T細胞表達的影響（n＝3）

3.2 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對sCTLA?4 的影響 與空白對照組比較，單體組、復方組、單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組sCTLA?4 表達降低（P＜0.01）；與單體組比較，復方組、單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組sCTLA?4 表達降低（P＜0.01）；與復方組比較，單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組sCTLA?4 表達降低（P＜0.01）；與單抗組比較，復方＋單抗組sCTLA?4 表達降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對sCTLA?4 的影響（n＝3）

3.3 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對共培養體系中Lewis 肺癌細胞增殖的影響 與空白對照組比較，單體組、復方組、單抗組、單體＋單抗組和復方＋單抗組Lewis 肺癌細胞存活率降低（P＜0.01）；與單體組比較，復方組、單體＋單抗組和復方＋單抗組Lewis 肺癌細胞存活率降低（P＜0.01）；與復方組比較，單體＋單抗組和復方＋單抗組Lewis 肺癌細胞存活率降低（P＜0.05）；與單抗組比較，單體＋單抗組和復方＋單抗組Lewis 肺癌細胞存活率降低（P＜0.01）；與單體＋單抗組比較，復方＋單抗組Lewis 肺癌細胞存活率降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 益氣養陰解毒方及黃芪甲苷對Lewis 肺癌細胞增殖的影響（n＝3）

4 討論

免疫應答過程中T細胞的激活需要雙信號作用。第一信號主要來自T細胞抗原識別受體與抗原肽?主要組織相容性復合體的特異性結合；第二信號由一系列共刺激分子提供，免疫檢查點就是其中負性共刺激分子，主要包括CTLA?4、程序性死亡分子1（programmed death 1，PD?1）及程序性死亡分子1 配體（PD?1 ligand，PD?L1）等，其作用類似于T細胞的“制動系統”，抑制特異性T細胞的活化、增殖，限制免疫系統對自身健康細胞進行攻擊。然而，惡性腫瘤利用免疫檢查點這一特性逃避機體免疫殺傷。CTLA?4 主要在外周淋巴器官中抑制T細胞的活化［11］，在腫瘤微環境中亦可發揮免疫抑制作用［12］。sCTLA?4 是由于CTLA?4 選擇性剪切使CTLA?4 基因缺失第三外顯子而形成，亦與B7分子結合，阻斷CD28／B7 通路，抑制機體免疫功能［13］。

中醫學認為“正氣虧虛”是肺癌發生、發展的根本，邪毒則是肺癌發生的重要條件。早在20 世紀70年代，劉嘉湘教授在全國率先系統地提出“扶正治癌”學術思想和治療方法，通過提高機體自身抗癌能力達到“人瘤共存”“帶瘤生存”的目的，其機制可以從調節機體免疫功能方面深入研究。益氣養陰解毒方是“扶正法”治療肺癌的代表方，由生黃芪、北沙參、天冬、麥冬、女貞子、山茱萸、絞股藍、仙靈脾、葫蘆巴、石上柏、石見穿、重樓組成。生黃芪補益肺脾之氣，北沙參滋養肺胃之陰液、潤肺止咳，共為君藥；天冬、麥冬、女貞子、山茱萸、絞股藍為臣藥，增強益氣養陰的功效；仙靈脾、葫蘆巴、石上柏、石見穿、重樓為佐藥，仙靈脾、葫蘆巴具有溫腎陽，暖脾陽之功，其與黃芪合用，益氣作用更強，其與滋養陰液諸藥同用，則剛柔相濟，石上柏、石見穿、重樓清熱解毒，祛邪以扶正；天冬在本方中又取其入肺經亦作為使藥之用。全方具有益氣養陰、清熱解毒之功效。研究顯示，益氣養陰解毒方及其類方具有穩定瘤灶、延長生存期的作用，機制與改善機體外周細胞免疫功能相關［5?6］。黃芪甲苷是黃芪最主要的單體活性成分，具有調節免疫系統、下調免疫抑制因子IDO 表達以及增強對抗癌藥物敏感性等作用［8?9，14］。本課題組前期研究顯示，晚期非小細胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）患者外周血中sCTLA?4 高表達［15］；益氣養陰解毒方及其類方的作用機制可能為下調晚期NSCLC 患者外周血中sCTLA?4 的表達［7］。由此，推測調控CTLA?4 介導的肺癌外周及微環境的免疫耐受可能是益氣養陰解毒方的重要作用機制之一，值得進一步深入研究。

基于中醫“扶正法”提高自身抗癌能力的治療理念，本實驗并非觀察中藥復方及單體直接抑制腫瘤細胞增殖的作用，而是運用淋巴細胞與腫瘤細胞共培養的方法，探討益氣養陰解毒方及黃芪甲苷是否通過下調CTLA?4 表達，進而增強免疫細胞對腫瘤細胞的殺傷作用，并觀察中醫藥與免疫檢查點抑制劑的協同增效作用。研究發現，黃芪甲苷、益氣養陰解毒方、抗CTLA?4 單抗均能下調共培養體系中mCTLA?4 和sCTLA?4 的表達，提高CD8＋T細胞水平，黃芪甲苷或益氣養陰解毒方聯合抗CTLA?4 單抗具有協同增效的作用。研究證實，益氣養陰解毒方及黃芪甲苷可以通過下調免疫抑制分子mCTLA?4 和sCTLA?4，逆轉CTLA?4 介導的肺癌免疫逃逸，從而發揮抗癌作用，體現了中醫“扶正治癌”提高自身抗癌能力的作用內涵。研究中，給藥組均提高了CD8＋T細胞的表達，可能與CD8＋T細胞中細胞毒殺傷性亞群的增殖有關，課題組后續研究將進一步對T細胞表型進行分析，并深入挖掘中醫藥如何調控CTLA?4 表達的分子機制，以期為完善中醫“扶正治癌”的作用機制提供研究基礎。