散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠痛經的作用機制

孫 蘭李家春劉莉娜 皇立衛 魏天楊王振中*

（1.江蘇食品藥品職業技術學院，江蘇 淮安223003； 2.江蘇財經職業技術學院，江蘇 淮安223003；3.江蘇康緣藥業股份有限公司，江蘇 連云港222001； 4.中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇連云港222001）

痛經是指月經期間下腹部出現痙攣性疼痛，是最常見的婦科疾病之一，有時伴有惡心、嘔吐、腹瀉、頭痛和頭暈等全身癥狀［1］。臨床上痛經分為原發性痛經和繼發性痛經2種類型，前者是指生殖器官無器質性病變的痛經，后者是指盆腔器質性疾病所引起的痛經［2］。育齡婦女原發性痛經的患病率為30%～50%，有10%左右的病人，疼痛難于忍受，每月有1～3 d 或更長時間不能正常工作、生活，必須接受治療［3］。現代醫學認為原發性痛經的發生與月經時子宮內膜前列腺素（prostaglandin，PG）水平增高有關［4］。研究表明痛經患者子宮內膜和月經血中前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）水平較正常婦女明顯升高［5］。另外，痛經也與子宮平滑肌不協調收縮，造成子宮供血不足，導致厭氧代謝物積貯，刺激疼痛神經元有關［6］。

散結鎮痛膠囊由龍血竭、三七、浙貝、薏苡仁4 味藥材組成，臨床用于治療子宮內膜異位所致的繼發性痛經、月經不調、盆腔包塊、不孕等。研究表明，散結鎮痛膠囊顯著減輕原發性痛經患者的癥狀，降低經期血漿PGF2α水平［7］，課題組在研究中發現，散結鎮痛膠囊能抑制小鼠子宮平滑肌細胞內鈣離子內流，減輕子宮平滑肌細胞收縮［8］。但散結鎮痛膠囊治療原發性痛經的機制尚不明確，本實驗通過縮宮素誘導的小鼠痛經模型，研究散結鎮痛膠囊體內抗痛經作用，并探討其作用機制，以期為臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 ICR 小鼠，雌性，體質量18～22 g，購自揚州大學比較醫學中心，實驗動物生產許可證號SCXK（蘇）2017?0007，分籠飼養，自由飲水。

1.2 試劑與藥物 散結鎮痛膠囊（批號20180216，江蘇康緣藥業股份有限公司）；布洛芬緩釋膠囊（批號171106，福建太平洋制藥有限公司）；苯甲酸雌二醇注射液（批號20171116，寧波第二激素廠）；縮宮素注射液（批號170516，上海禾豐制藥有限公司）；生理鹽水（山東齊都藥業股份有限公司）；羧甲基纖維素鈉（批號20161012，中國醫藥［集團］上海化學試劑公司）；PGF2αELISA 檢測試劑盒（批號20190928，南京建成生物有限公司）；一氧化氮（nitric oxide，NO）檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所）；RIPA 裂解液（碧云天生物技術研究所）；BCA 蛋白定量試劑盒（北京普利萊基因有限公司）；兔抗COX?2 抗體（cyclooxygenase?2，ab15191，英國Abcam 公司）；兔 抗 P?MLC20 抗 體（myosin light chain 20 phosphorylation，3675，美國CST 公司）；羊抗兔的IgG?HRP 二抗（ab6721，美 國CST 公司）；ECL Western Blotting Substrate 試劑盒（英國Abcam公司）。

1.3 儀器 BS224S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；ChemiDoc XRS型凝膠成像系統（美國Bio?Rad 公司）；FlexStation 3 多功能酶標儀（美國Molecular Devices 公司）；5840型冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；勻漿器（德國IKA公司）。

2 方法

2.1 造模、分組及給藥 參照文獻［9］的方法復制小鼠痛經模型。60 只雌性ICR 小鼠按體質量隨機分成6組，即正常組、模型組、陽性組（布洛芬緩釋膠囊，0.1 g／kg），散結鎮痛膠囊高、中、低劑量組（1.80、0.90、0.45 g／kg）組，每組10只。除正常組外（背部注射生理鹽水），其余組小鼠皮下注射雌激素0.05 mg／只，連續7 d，注射激素同時開始灌胃給藥，1 次／d，連續7 d，正常組、模型組灌胃等體積0.5 %羧甲基纖維素鈉混懸液，給藥容量20 mL／kg。末次灌胃1 h 后，除正常組外，其余組各鼠腹部注射縮宮素注射液2 IU／只。觀察并記錄腹腔注射后30 min 內小鼠扭體次數。根據公式計算扭體次數抑制率（IR%），扭體抑制率% ＝（模型組扭體次數－藥物組扭體次數）／模型組×100%。

2.2 血清E2、NO 水平檢測 觀察扭體后眼眶取血，分離血清，采用放免法檢測E2 水平，根據說明書檢測NO 水平。

2.3 子宮組織PGF2α、Ca2＋水平檢測 脫頸椎處死小鼠取子宮，按照子宮組織?生理鹽水＝1∶9 比例，放入2 mL EP 管中，用勻漿器充分勻漿，3 000 r／min離心分離上清，用ELISA 法按操作說明書檢測PGF2α水平，采用比色法檢測Ca2＋水平。

2.4 免疫印跡法檢測子宮組織COX?2、P?MLC20蛋白表達 用電子天平精確稱量子宮濕質量后，提取子宮組織總蛋白，用BCA 方法進行蛋白定量。各組取50 μg 的蛋白質進行12%聚丙烯酰胺凝膠電泳。蛋白質轉至PVDF 膜上后，用20 mL 5% BSA封閉，放在水平搖床上室溫平穩搖動2 h。TBST 洗滌3 次后，PVDF 膜加入稀釋的一抗（COX?2、P?MLC20、GAPDH 稀釋的比例分別為1∶2 000、1∶1 000、1∶1 000），4 ℃孵育過夜。第2 天用TBST洗PVDF 膜3 次，隨后加入稀釋二抗（1∶5 000 稀釋），室溫輕搖孵育2 h。TBST 漂洗膜3 次，加入ECL 化學發光劑，進行顯影，用凝膠圖象處理系統自動分析目的條帶分子量和灰度值進行定性定量分析。

2.5 免疫組化法檢測子宮組織ERα 蛋白表達 子宮組織標本經4%多聚甲醛固定后，常規脫水，石蠟包埋。石蠟切片常規脫蠟至水。PBS 洗3 次，每遍5 min。用蒸餾水或PBS 配置新鮮的3% H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗1 次，抗原修復，PBS 洗5 min，甩去多余液體滴加一抗（ERα，1∶200 稀釋）室溫下孵育60 min 或4 ℃過夜（過夜后在37 ℃復溫45 min），PBS 洗3 次各5 min，甩去PBS 液，每張切片加50 μL MaxVision TM 試劑，室溫下孵育15 min，PBS 洗3 次各5 min，每張切片加100 μL 新鮮配制的DAB 溶液，顯微鏡下觀察3 min，陽性顯色為棕色。蒸餾水洗終止染色，蘇木素復染，0.1 %鹽酸分化，自來水沖洗，PBS 沖洗返藍，梯度乙醇脫水，透明，封片。每張切片取5個高倍視野，用Image Pro Plus 5.0.2圖像分析軟件測定各組光密度值。

2.6 統計學分析 通過Graphpad Prism 5.0 軟件進行處理，結果以（）表示，多樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠扭體反應的影響 與模型組比較，布洛芬組（0.10 g／kg）、散結鎮痛膠囊 低、中、高劑量組（0.45、0.90、1.80 g／kg）小鼠扭體次數減少（P＜0.05，P＜0.01），其抑制率分別為74.6%、47.5%、57.6%、68.2%。結果提示，散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導的小鼠痛經具有抑制作用。結果見表1。

表1 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠扭體反應的影響（， n＝10）Tab.1 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on frequency of oxytocin?induced writhing in mice（， n ＝10）

表1 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠扭體反應的影響（， n＝10）Tab.1 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on frequency of oxytocin?induced writhing in mice（， n ＝10）

注：與正常組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.2 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠血清E2、NO 水平的影響 與正常組比較，模型組血清中E2水平升高，NO 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，散結鎮痛膠囊低、中、高劑量組血清E2 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），NO 水平升高（P＜0.05，P＜0.01）。結果見表2。

表2 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠血清E2、NO 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on serum E2 and NO levels of oxytocin?induced mice（， n＝10）

表2 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠血清E2、NO 水平的影響（， n＝10）Tab.2 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on serum E2 and NO levels of oxytocin?induced mice（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃ P ＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響 與正常組比較，模型組子宮組織PGF2α、Ca2＋水平增加（P＜0.01）；與模型組比較，散結鎮痛膠囊中、高劑量組子宮組織PGF2α、Ca2＋水平降低（P＜0.05，P＜0.01），散結鎮痛膠囊低劑量組子宮組織Ca2＋水平降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric PGF2αand Ca2＋levels in the oxytocin?induced mice（， n＝10）

表3 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織PGF2α、Ca2＋水平的影響（， n＝10）Tab.3 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric PGF2αand Ca2＋levels in the oxytocin?induced mice（， n＝10）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達升高（P＜0.01）；與模型組比較，散結鎮痛膠囊組COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達均降低（P＜0.05，P＜0.01）。見圖1～2、表4。

圖1 各組子宮組織COX?2、P?MLC20 及GAPDH 蛋白表達Fig.1 Uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20 and GAPDH in mice

圖2 各組子宮組織ERα 蛋白表達（IHC， ×200）Fig.2 Uteric ERα protein expression in mice（IHC， ×200）

表4 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20， ERα in oxytocin?induced mice（， n＝3）

表4 散結鎮痛膠囊對縮宮素誘導小鼠子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達的影響（， n＝3）Tab.4 Effects of Sanjie Zhentong Capsules on uteric protein expressions of COX?2， P?MLC20， ERα in oxytocin?induced mice（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

4 討論

現代醫學認為原發性痛經與前列腺素（PGs）密切相關，痛經患者體內PGF2α水平明顯升高［10］。PGF2α與其動脈壁上的受體結合，使子宮平滑肌痙攣性收縮，進而導致子宮缺血、缺氧、酸性代謝產物在肌層堆積而致痛經，降低子宮平滑肌PGF2α的分泌，可以有效抑制其痙攣性收縮，血液循環改善，缺血狀態緩解［11］。縮宮素與子宮平滑肌細胞縮宮素受體結合，生成的DAG（diacylglycerol）激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），通過絲裂原激活的蛋白激酶（mitogen?activated protein kinase，MAPK）路徑生成PGs 類物質，引起子宮收縮［12］。NO 由血管內皮細胞產生，通過調節子宮血管張力和血流量，進而參與痛經的發生。NO 對血管調節主要是通過左旋精氨酸?NO?環磷鳥苷途徑實現，當其含量下降時，可以促使傷害性信息傳遞而導致疼痛［13］。本實驗結果顯示，模型組小鼠子宮組織PGF2α升高，血清NO 含量降低。給予散結鎮痛膠囊后，小鼠子宮組織PGF2α含量顯著降低，血清NO 含量顯著升高。提示散結鎮痛膠囊通過調節PGF2α及NO 而對原發性痛經具有一定治療作用。COX 是參與PGs 的生物合成的限速酶。臨床上常用非甾體類抗炎藥治療原發性痛經，其機制主要是通過抑制COX 而減少PGs 的生成。月經期間，COX?2 高表達使PGF2α增加可能是原發性痛經的主要機制［14］，這也解釋了選擇性COX?2 抑制劑改善原發性痛經的治療效果。為進一步研究散結鎮痛膠囊調節PGs 產生的機制，對子宮組織COX?2 蛋白的表達進行了分析。實驗結果表明，散結鎮痛膠囊能夠顯著抑制COX?2 蛋白表達，結果提示，散結鎮痛膠囊治療痛經與抑制COX?2 信號通路有關。

Ca2＋在細胞收縮等反應中起關鍵作用。在子宮發生缺血等損傷后，誘導鈣離子通道開放，使細胞質內Ca2＋濃度急劇增高，進而導致細胞膜受損，致使子宮痙攣，產生疼痛［15］。本實驗結果顯示，模型組小鼠子宮組織Ca2＋升高。給予散結鎮痛膠囊后，小鼠子宮組織Ca2＋含量顯著降低。提示散結鎮痛膠囊對原發性痛經的治療與減少Ca2＋相關。子宮平滑肌收縮與肌球蛋白輕鏈（MLC20）的磷酸化相關［16］。在本研究中，可觀察到原發性痛經動物子宮組織模型中P?MLC20 表達均顯著增加，散結鎮痛膠囊能顯著抑制P?MLC20 表達，可見，散結鎮痛膠囊能通過抑制MLC20 的磷酸化而減輕子宮收縮，從而防治原發性痛經。

研究認為原發性痛經與E2 的異常升高有關，E2 的生物學效應強弱與靶細胞內雌激素受體（ER）的水平密切相關［17］。ERα 作為ER 的主要亞型之一，在子宮中起主導作用，可以通過對子宮蠕動的調節來改變子宮收縮強度，以減輕痛經程度［18］。另外，研究發現，ER 表達與前列腺素的合成、釋放有關，通過影響PG 從而對痛經產生影響，ER 降低則PG 合成與釋放減少，從而可緩解血管平滑肌的痙攣性收縮，減緩痛經程度［19］。本實驗結果顯示，散結鎮痛膠囊可降低小鼠子宮組織ERα 蛋白表達，這一結果提示散結鎮痛膠囊可以通過調節內分泌而改善痛經癥狀。

綜上所述，散結鎮痛膠囊能有效抑制縮宮素引起的小鼠痛經反應。其機制可能是通過抑制子宮組織COX?2、P?MLC20、ERα 蛋白表達，從而減少PGF2α、Ca2＋及E2 的生成。