田薊苷對高脂飲食ApoE?／?小鼠抗動脈粥樣硬化活性及作用機制

姜 雯 楊 浩 席 梅 于 寧*

（1.新疆醫科大學第六附屬醫院，新疆 烏魯木齊830000； 2.新疆維吾爾自治區藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004）

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）是中國乃至全世界范圍內死亡的主要原因之一［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis）是多種CVD 的病理學基礎，研究報道［2］血脂代謝異常，尤其是膽固醇代謝紊亂是動脈粥樣硬化最主要的危險因素。他汀類藥物被廣泛用于臨床改善血脂，但單純使用他汀類藥物治療的高膽固醇血癥很難達到指南推薦的低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）目標［3］。此外，有些患者不能耐受他汀類藥物的不良反應。因此，尋找安全性高且具有調節血脂和改善動脈粥樣硬化作用的中藥材，為抗動脈粥樣硬化提供了思路。香青蘭Dracoceohalum moldovicaL.為唇形科香青蘭的干燥地上部分，具有益心護腦、保肝健胃、開通腦中閉塞的功效，用于治療冠心病、高血壓、氣管炎等疾病［4］。研究表明［5?8］，田薊苷在香青蘭總黃酮中含量最高，其抗動脈粥樣硬化的潛在機制可能與抑制血管緊張素Ⅱ誘導的轉化生長因子?β／Smad 信號通路有關，也可能通過抗炎作用發揮抗動脈粥樣硬化作用。以上研究明確了田薊苷在抗動脈粥樣硬化方面的潛在價值，但對其在調節血脂藥效及作用機制方面的研究仍十分欠缺。因此，為進一步探討田薊苷在抗動脈粥樣硬化疾病中發揮的作用，本研究以高脂飲食 ApoE 基因敲除（ApoE knockout，ApoE?／?）小鼠為研究對象，探索田薊苷對血脂代謝水平、肝臟中磷脂酰肌醇3?激酶／蛋白激酶B（phosphoinositide 3?kinase／protein kinase B，PI3K／AKT）信號通路和固醇調節元件結合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP?2）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）蛋白表達的影響，以期為闡明田薊苷抗動脈粥樣硬化的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 田薊苷標準品（北京英萊克科技發展有限公司，批號4291?60?5，純度≥98%）；阿托伐他汀鈣（美國Sigma 公司，批號PHR1422?1G，純度≥98%）。總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號141741）、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒（批號146851）、LDL?C 試劑盒（批號120231）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C）試劑盒（批號120241）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號1007150）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號1007143）、葡萄糖測定試劑盒（批號180851）購自中生北控生物科技股份有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號SNM281）；β?actin 一抗（北京義翹神州公司，批號100166?MM10）；辣根過氧化物酶（HRP）標記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP 標記山羊抗兔IgG 二抗（英國Abcam 公司，批號ab205718、ab205719）；其余試劑均為分析純或實驗室常用規格，水為蒸餾水。

1.2 動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雄性遺傳背景C57BL／6 J 的ApoE?／?小鼠60 只，體質量（24.0±1.5）g，購自新疆醫科大學動物實驗中心，實驗動物生產許可證號SCXK（新）2018?0002，飼養在新疆醫科大學動物實驗中心SPF 級動物房中，動物飼養、處理和手術過程由新疆醫科大學第六附屬醫院動物保護與使用委員會審核、批準和監督。室溫20～25 ℃，濕度55%～65%，光照／黑暗12 h 循環，飼養期間小鼠自由飲水與進食。普通飼料（脂肪13%，蛋白質22%，碳水化合物65%，批號LAD 0011），高脂飼料（脂肪42%，蛋白質14%，碳水化合物44%，膽固醇含量0.2%，批號TP 26304）購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 儀器 EPS301型電泳儀、Hoefer SE250型垂直電泳槽、TE22 小型轉膜電泳槽（美國Amersham Biosciences 公司）；3?18K 高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Innova 43型恒溫搖床（英國New Brunswick Scientific 公 司）；ABI QuantStudioTM6 Flex 實時熒光定量PCR 儀（美國應用生物系統公司）；Gel Doc XR型凝膠成像系統（美國Bio?Rad公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 適應性喂養1 周，隨機分為6組，即普通飲食組、高脂飲食組、田薊苷低劑量給藥組（40 mg／kg）、田薊苷中劑量給藥組（120 mg／kg）、田薊苷高劑量給藥組（200 mg／kg）、阿托伐他汀給藥組（15 mg／kg），每組10 只，1 次／d，連續飼養12 周。普通飲食組及高脂飲食組每天灌 胃 0.5% 羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC?Na），阿托伐他汀給藥組、田薊苷給藥組每天灌胃用0.5%CMC?Na 溶解的相應藥物。普通飲食組小鼠給予普通飼料，高脂組，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠給予高脂飼料喂養。

2.2 血脂代謝水平檢測 12 周后，6組ApoE?／?小鼠禁食不禁水12 h，5%戊巴比妥麻醉后，腹主動脈采血，3 000 r／min 離心10 min，收集上清，分裝標記。嚴格按照試劑盒說明書檢測血清TC、TG、HDL?C、LDL?C、ALT、AST、TBA、空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）水平。

2.3 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟組織中相關蛋白表達的影響 稱取肝臟組織約50 mg 至1 mL T?PER／cocktail 裂解液中，生物樣品均質器破碎40 s，16 000g離心10 min，吸取上清，1∶4 稀釋，BCA蛋白定量，添加蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，Western blot 檢測肝臟組織PI3K、磷酸化?PI3K（p?PI3K）、AKT、磷酸化?AKT（p?AKT）、SREBP?2和LDLR 蛋白水平的變化。

2.4 田薊苷對ApoE?／?小鼠主動脈的影響 動脈粥樣硬化程度由主動脈上油紅O 染色的脂質沉積來進行評估，在解剖鏡下將主動脈外周多余的脂肪剝離，剝凈后將主動脈沿背部剖開，接下來進行油紅O 染色，用Image J 測定面積，計算主動脈斑塊面積占總血管面積之比。

2.5 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行分析，數據以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較的事后檢驗分析采用Student?Newmnan?Keuls 檢驗法。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 田薊苷對ApoE?／?小鼠血糖血脂的影響 與普通飲食組比較，高脂飲食組ApoE?／?小鼠連續服用高脂飼料12 周后血清中TC、TG、LDL?C 和FBG水平均升高，而HDL?C 和TBA 水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。與高脂飲食組相比，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TC 水平降低，田薊苷高劑量組ApoE?／?小鼠血清TG 水平降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）；田薊苷低、中劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TG 水平無明顯變化（P＞0.05）。

與高脂飲食組比較，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清LDL?C 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）；血清HDL?C 和FBG 水平無明顯變化（P＞0.05）。與高脂飲食組比較，阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TBA 水平降低（P＜0.05），田薊苷低、中、高劑量組ApoE?／?小鼠血清中TBA 水平無明顯變化（P＞0.05）。見圖1。

圖1 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠血糖血脂代謝水平（， n＝10）Fig.1 Levels of blood lipids and sugar in ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

3.2 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟功能的影響 12 周后，各組ApoE?／?小鼠血清ALT 和AST 水平無明顯變化（P＞0.05）。見圖2。

圖2 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠肝功能變化（， n＝10）Fig.2 Changes in liver functions of ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

3.3 田薊苷對ApoE?／?小鼠主動脈斑塊的影響 12周后，油紅O 染色結果顯示，與普通飲食組比較，高脂飲食組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊增多（P＜0.01）。與高脂飲食組比較，田薊苷低、中、高劑量給藥組及阿托伐他汀給藥組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊的沉積減少（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊變化（， n＝10）Fig.3 Changes in aortic plaque area of ApoE?／? mice on high?fat diet after 12?week administration（，n＝10）

3.4 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟組織中相關蛋白表達的影響 12 周后，檢測結果顯示，與普通飲食組比較，高脂飲食ApoE?／?小鼠肝臟組織中PI3K 和AKT 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達降低（P＜0.05）。與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀給藥組ApoE?／?小鼠肝臟組織中PI3K 和AKT 蛋白表達無明顯變化（P＞0.05），p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠相關蛋白表達（，n＝10）Fig.4 Changes in hepatic protein expressions of ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

4 討論

ApoE?／?小鼠是研究動脈粥樣硬化疾病常用的動物模型之一［9?10］，原因是ApoE?／?小鼠血脂代謝存在異常，可顯著誘發多余脂質在血管內堆積，自發形成動脈粥樣硬化斑塊，通過高脂飲食可加速ApoE?／?小鼠血管動脈粥樣硬化斑塊的形成，其斑塊分布和病理學特征與人體血管動脈粥樣硬化斑塊較為相似。因此，本研究以高脂飲食的ApoE?／?小鼠為動脈粥樣硬化動物模型。國內研究人員發現［11］，通過非極性和極性溶劑，如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取的香青蘭成分均能夠降低正常大鼠TC、TG 和LDL?C 水平，提示香青蘭中黃酮類及萜類等多種活性成分具有調節血脂水平的作用。田薊苷在香青蘭總黃酮中含量最高，故本研究探討田薊苷對高脂飲食ApoE?／?小鼠血脂代謝和抗動脈粥樣硬化的作用。

本研究給予高脂飲食ApoE?／?小鼠田薊苷12 周后，發現與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TC 水平降低，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組血清LDL?C 水平降低、主動脈斑塊的沉積減少，說明田薊苷可降低高脂飲食ApoE?／?小鼠血脂代謝水平，減少主動脈斑塊沉積。研究發現［12?13］PI3K／AKT 信號通路參與調控HepG2細胞脂質代謝和LDLR 蛋白的表達。LDLR 蛋白的表達受到多層次的調控，但在LDLR的啟動子區內存在SREBPs 結合位點，哺乳動物細胞中SREBP?2 是LDLR 的主要激活因子在脂蛋白的代謝中發揮重要作用［14］。本實驗研究發現，與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量給藥組和陽性對照阿托伐他汀給藥組均能上調ApoE?／?小鼠肝組織的SREBP?2 和LDLR 蛋白的表達，說明田薊苷抗動脈粥樣硬化作用可能與調節肝臟中SREBP?2 和LDLR蛋白表達有關。SREBP?2 蛋白可激活PI3K／AKT 信號通路［15］，該信號通路在抗動脈粥樣硬化中發揮重要作用［16］。本研究發現，與普通飲食組比較，高脂飲食可以導致ApoE?／?小鼠肝臟p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達降低，高劑量田薊苷和阿托伐他汀可上調SREBP?2 蛋白的表達。田薊苷發揮調節血脂代謝、抗動脈粥樣硬化的關鍵靶點是否與SREBP?2 蛋白有關，課題組將在后續的研究中通過體外細胞實驗，沉默SREBP?2 蛋白的表達，進一步觀察田薊苷的作用機制。此外，田薊苷高劑量組在降低ApoE?／?小鼠血清中TC 和LDL?C 水平，減少主動脈及主動脈根部斑塊，以及減少肝臟脂質沉積效果與阿托伐他汀組效果相近，但田薊苷與阿托伐他汀的作用機制是否相同，仍需進一步研究。

綜上所述，田薊苷能降低ApoE?／?小鼠血清中TC 和LDL?C 水平，并存在劑量依賴性。同時，高劑量的田薊苷可上調ApoE?／?小鼠肝臟中p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白的表達，減少主動脈斑塊沉積和肝臟脂質沉積。由此推測田薊苷發揮抗動脈粥樣硬化作用可能與激活肝臟中PI3K／AKT信號通路，調節SREBP?2 蛋白表達，從而上調LDLR 蛋白表達，增加LDL?C 被攝取途徑有關，但其機制還需進一步深入研究。