基于鉑、鈀負載的MoS2納米片構建生物傳感器及應用

周麗亞，周棲桐，趙聰俐，姜艷軍，馬麗，賀瑩

（1河北工業大學化工學院，天津 300130；2天津中醫藥大學健康科學與工程學院，天津 301617）

自單原子層石墨烯發現后，以其為代表的二維納米材料得到了深入的研究，除石墨烯外，其他的二維材料，尤其是過渡態金屬硫化物，特別是二硫化鉬（MoS2），由于價格低、化學性質穩定、良好的電催化活性等優異性能引起了研究工作者極大的興趣[1-4]。MoS2本身的導電率較低，二維的片層結構之間主要依賴范德華力隔開的S—Mo—S鍵緊密堆疊而成，在循環使用的過程中易發生團聚，抑制了電子的傳遞能力，降低了導電能力[5-6]。為了解決上述問題，擴大MoS2的使用范圍，已經有研究通過各種方法改善MoS2的性能，如Yousaf等[7]采用水熱法利用乙二醇為還原劑在MoS2納米片上負載了Co和Ni的納米顆粒，由于Co和Ni之間的協同作用提高了電催化活性，降低了電子傳遞的阻礙，在析氫電催化反應中體現出催化性能要優于商品化的Pt/C催化劑。Wang等[8]利用水熱法和溶劑法連續反應制備了海膽狀的CoS/MoS2納米球，CoS納米顆粒生長在MoS2納米片層的表面，納米片自組裝成球形納米顆粒，制備的納米復合物有豐富的活性位點和高的導電性。但將MoS2復合材料應用于生物傳感器領域要求電極表面的納米材料具有盡可能高的比表面積。因此，如何在有限的電極表面盡可能多地提高納米材料的表面積、提高電子轉移能力，是發揮二維納米材料優異性能的關鍵。鉑和鈀同屬于鉑族元素，具有良好的生物兼容性和電催化性能，因此將金屬Pt、Pd修飾在MoS2上，利用MoS2中的硫原子使Pt、Pd在分子層中共價結合，通過沿z軸的范德華力作用堆疊在一起，可以改變MoS2的能帶結構、增加導電性能、提高生物相容性，從而拓展MoS2在傳感、儲能等多領域的應用。

當前國家大力提倡餐桌上的安全和環境保護，有機磷農藥（OPs）作為常用的一類殺蟲劑在控制農作物病蟲害和農業增產增收方面發揮著重要作用，但是過度使用OPs而引起的農藥殘留問題已經成為影響環境和食品安全的重大隱患。生物傳感器法檢測OPs由于具有響應快、操作簡便、微型化和可現場檢測等優點成為當今研究的熱點[9]。本文首先將塊狀二硫化鉬剝離成片層狀二硫化鉬納米片，并將Pt和Pd金屬納米顆粒負載于二硫化鉬納米片上，通過SEM、TEM、XRD和XPS等材料學表征手段考察其結構和組成，并將該納米復合物修飾玻碳電極制備乙酰膽堿酯酶生物傳感器，考察其對OPs的檢測性能。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗試劑

乙酰膽堿酯酶（AChE，EC3.1.1.7）、馬拉硫磷、甲基對硫磷和pluronic F127購買于Sigma；二硫化鉬（MoS2）、抗壞血酸、氯化硫代乙酰膽堿（ATCl）、四氯鈀酸鈉（Na2PdCl4）、氯亞鉑酸鉀（K2PtCl4）、氯鉑酸（H2PtCl6）、鐵氰化鉀［K3Fe(CN)6］、Pt/C、殼聚糖等購自上海阿拉丁公司。

1.2 試驗儀器

電化學工作站（CHI650E），上海辰華儀器有限公司；高速控溫離心機（3K18），Sigma公司；掃描電子顯微鏡（JSM-6700F），日本JEOL公司；透射電子顯微鏡（2100f），日本JEOL公司；X射線光電子能譜（Escalab 250Xi），上海辰華儀器有限公司；數控超聲波清洗器（KQ2200DB），昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 納米復合物的制備方法

1.3.1 Pt-Pd/MoS2的制備

首先將塊狀二硫化鉬剝離成層狀，取MoS260mg，加入乙醇和水（體積比9∶11）共10mL，將混合物置于超聲振蕩器中，50Hz超聲8h后，在離心機中3000r/min離心20min，取上清液，置于高速離心機中10000r/min離心10min，取沉淀物，真空冷凍干燥后備用。

將F127（10mg）充分溶解于0.7mL H2PtCl6（10mmol/L）、0.7mL K2PtCl4（10mmol/L）和0.7mL Na2PdCl4（10mmol/L）的混合溶液中，加入1mg的剝離后的MoS2混合均勻后，加入1.0mL 30mmol/L的抗壞血酸溶液，然后在超聲波50Hz、40℃下反應6h。反應結束后，用水和乙醇離心洗滌（14000r/min、10min）各3次去除模板F127，干燥后得到MoS2表面負載Pt和Pd納米顆粒的納米復合物（Pt-Pd/MoS2）。

1.3.2 介孔鉑鈀雙金屬納米花的制備過程

利用Yamauchi課題組[10]的改進方法，具體步驟如下：將F127（60mg）充分溶解于1.2mL H2PtCl6（20mmol/L）、1.8mL K2PtCl4（20mmol/L）和0.6mL Na2PdCl4（20mmol/L）的混合溶液中，加入60μL的鹽酸溶液（6.0mol/L）混合均勻后，加入3.0mL 0.1mol/L的抗壞血酸溶液，然后在超聲波50Hz、40℃反應4h。反應結束后，用水和乙醇離心洗滌（14000r/min，10min）各3次去除模板F127，干燥后得到產物介孔鉑鈀雙金屬納米花（MPtPdN）。

1.4 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE傳感器的制備

玻碳電極首先用0.05μm和0.3μm的拋光粉在麂皮上進行打磨，然后依次在硝酸溶液（0.1mol/L）、乙醇和超純水中超聲清洗，直至玻碳電極的表面呈光滑的鏡面。將Pt-Pd/MoS2（0.75μg）加入到1.0mL 0.2%的殼聚糖溶液中，超聲至形成均一的懸濁液。取6.0μL殼聚糖和Pt-Pd/MoS2復合物懸滴到處理好的玻碳電極上，室溫下自然干燥，得到Pt-Pd/MoS2/GCE電極，然后將6.0μL AChE溶液懸滴到Pt-Pd/MoS2/GCE電極上，室溫下自然干燥，然后用pH=7.5的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）清洗掉多余的AChE，干燥后即得到AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE電極。電極置于4℃冰箱中待用。作為對比MoS2/GCE、Pt/C/GCE和MPtPdN/GCE電極同樣按照類似的方法制備。

1.5 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE傳感器的電化學測量

采用三電極體系，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為輔助電極，修飾的玻碳電極為工作電極。在室溫條件下，利用循環伏安法（CV）和交流阻抗法（EIS）考察修飾電極的過程對響應電流的影響；通過時間電流法考察電極的響應性和酶對底物的親和能力；差分脈沖伏安法（DPV）測定OPs檢測的標準曲線。

1.5.1 電活性表面積的計算

通過Randles-Sevcik方程［式(1)］計算電活性表面積。

式中，n為參與反應的電子數；Ip為氧化峰電流值，μA；C為K3Fe(CN)6的濃度，mol/cm3；D為K3Fe(CN)6在溶液中的擴散系數，D=0.63×10-5cm2/s（20℃）；v為掃描速度，V/s；A為電極的電活性表面積。

1.5.2 動力學參數的計算

表觀米氏常數（Km）是衡量酶和底物親和能力的重要參數，反映生物傳感器電極表面生物酶的動力學特征。利用時間電流法，固定工作電壓為0.65V，在持續攪拌下每隔一段時間向PBS溶液中加入一定量不同濃度的ATCl溶液，得到時間-電流曲線（i-t曲線）。Km值可以通過Lineweaver-Burk方程［式(2)］進行計算。

式中，Is為加入ATCl后的電極的初始響應電流；C'為ATCl的濃度；Imax為電極的最大響應電流。通過分析Is與ATCl濃度的倒數關系[式(2)的斜率和截距]，可計算得到Km值。

1.5.3 農藥抑制率的測定及計算方法

在含有ATCl的PBS溶液中利用差分脈沖伏安法（DPV）測量AChE/CS-MPtPdN/GCE電極在OPs抑制前后在0.65V電壓下的響應電流峰值（抑制前后的響應電流峰值記為I0和I1），由式(3)可以計算得到響應的抑制率。

1.6 實際樣品的處理方法

市場上購買的卷心菜和黃瓜清洗干凈后，瀝干水分。取2g蔬菜樣品噴灑上2mL不同濃度的OPs，置于4℃冰箱中保存24h。再將混合物研磨成漿，加入10mL PBS（0.1mol/L，pH=8.5）超聲混勻，離心后將上清液轉移到100mL的容量瓶中，并用PBS溶液稀釋到刻度；取20mL上述溶液進行DPV測試。

2 結果與討論

2.1 層狀MoS2和Pt-Pd/MoS2的表征

Pt-Pd/MoS2的制備過程如圖1所示。圖2和圖3分別為剝離后的層狀MoS2和Pt-Pd/MoS2的掃描電鏡和透射電鏡照片，從圖2(a)和圖3(a)可以看出剝離后的MoS2呈現出層狀，且其邊緣有清晰的邊界，由圖2(b)和圖3(b)可以明顯看到在MoS2的表面上有大量納米顆粒附著，納米顆粒在片層表面分布均勻，基本沒有出現團聚現象。圖3(c)是Pt-Pd/MoS2的高倍透射電鏡照片，納米顆粒的尺寸在2～5nm，通過對晶格間距的分析，可知晶間條紋為0.274nm和0.625nm對應MoS2的(100)和(002)晶面[11]。晶間條紋為0.222nm和0.234nm對應Pt(111)和Pd(002)的晶面[12]。這說明Pt和Pd的納米顆粒成功修飾在MoS2的表面。通過面掃元素分析圖［圖3(d)］說明Pt-Pd/MoS2中S、Mo、Pt、Pd元素同時存在，也證明了Pt和Pd已經成功負載在MoS2納米片上。

圖1 Pt-Pd/MoS2的制備過程

圖2 剝離后的層狀MoS2和Pt-Pd/MoS2的掃描電鏡圖

圖3 剝離后的層狀MoS2和Pt-Pd/MoS2的透射電鏡圖

通過XPS表征方法考察MoS2和Pt-Pd/MoS2的化學組成和元素價態。圖4(a)為MoS2和Pt-Pd/MoS2的全波長譜圖，與MoS2的譜圖相比，除了都存在Mo、S、O、N、C元素外，在Pt-Pd/MoS2上有明顯的Pt和Pd的特征峰。圖4(b)是Mo 3d的高分辨譜，位于229.5eV和232.5eV處的峰是Mo的3d3/2和3d5/2自旋軌道，歸屬于MoS2中Mo4+，226.5eV處的峰是MoS2中S2-的2s軌道的特征峰[13-14]，236.0eV處的峰歸屬于Mo6+的3d3/2軌道，這可能是由于MoS2的表面有部分被氧化成為MoO3[12]；圖4(c)是Pd 3d的高分辨譜，335.1eV和341.5eV處的峰分別歸屬于Pd0的3d5/2和Pd2+的3d3/2軌道；圖4(d)是Pt 4f的高分辨譜，72.7eV和76.1eV處的峰歸屬于Pt 4f7/2和Pt 4f5/2自旋軌道[15]，說明在制備的材料中存在Pt金屬納米顆粒；圖4(e)是S 2p的高分辨譜，161.7eV和163.1eV處的峰分別歸屬于S2-的2p1/2和2p3/2的特征峰[16]。

圖4 MoS2和Pt-Pd/MoS2的XPS圖譜

2.2 制備電極的電化學性能

圖5(a)為空白電極、Pt-Pd/MoS2/GCE、Pt/C/GCE、MPtPdN/GCE和MoS2/GCE在含有5.0mmol/L K3Fe(CN)6和0.1mol/L KCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）溶液中的循環伏安圖，由圖可以看出，綠色線條對應Pt-Pd/MoS2/GCE電極的掃描結果具有最大的氧化還原峰，略高于商品化的Pt/C制備的電極，同時遠遠高于MPtPdN/GCE和Pt/C/GCE，說明制備的Pt-Pd/MoS2納米復合物在降低貴金屬用量的同時達到更好的電化學性能。圖5(b)為空白電極、Pt-Pd/MoS2/GCE、Pt/C/GCE、MPtPdN/GCE和MoS2/GCE的交流阻抗圖，Pt-Pd/MoS2/GCE在低頻區的半圓直徑最小，明顯低于MoS2/GCE，說明Pt-Pd/MoS2/GCE與其他電極相比具有較小的阻抗，這主要是因為Pt和Pd本身就是良好的電子傳遞介體，其次Pt和Pd調節了二硫化鉬納米片的能帶結構，使其電導性能提高。通過Randles-Sevcik公式計算Pt-Pd/MoS2/GCE電極的電活性表面積為0.2917cm2。

圖5(c)是空白電極、Pt-Pd/MoS2/GCE、MoS2/GCE、AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE和AChE/MoS2/GCE在含有1.0mmol/L ATCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）中的循環伏安圖。由圖5(c)可以看到，只有AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE和AChE/MoS2/GCE兩支電極在0.65V附近出現明顯的不可逆氧化峰，而其他的電極都沒有氧化峰出現，同時AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE（綠色）比AChE/MoS2/GCE（紫色）的峰電流值更高，也進一步印證了Pt-Pd/MoS2具有優異的電化學性能。圖5(d)為AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在50～150mV/s的掃描速度下的循環伏安圖，由掃描速度和氧化峰電流值的擬合曲線可知，掃描速度在50～150mV/s范圍，掃描速度與氧化峰電流值呈線性關系，擬合方程為y=0.01227x+3.165（R2=0.9960），相較于掃描速度的平方根與氧化峰電流值的關系，具有更好的擬合效果，因此可說明在AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE電極表面發生的反應屬于表面控制。

圖5 制備電極的電化學性能

2.3 試驗條件的優化

2.3.1 pH對生物傳感器響應的影響

由于反應體系的pH對AChE充分發揮催化活性具有顯著的影響，因此考察不同的pH（6.5～8.5）對氧化峰電流的影響。如圖6(a)所示，在pH為7.5時具有最大的氧化峰電流值，這與AChE的最適pH一致，因此后續試驗選擇pH為7.5。

天上繁星歷歷，星光在宇宙中旅行千百億年，將能量匯聚在一起，又分散開來，分分合合之間，無數的時空生生滅滅，連光都逃不出的宇宙，它的邊界在哪里？由星空往下，在茫茫寰宇中，大唐像一片樹葉？長安像樹葉之中的一個斑點？萬花谷？針尖一般的美夢?，F在夜露下降，凝結在萬花谷的草木之上，滋養生息，任其枯榮成敗。由三星望月到云錦臺，由一間小剎到仙跡巖，由攬星潭到天工坊，由水月宮到千機閣，由聾啞村到更遠的絕情谷，桃源的燈火一盞一盞地滅掉。再平常不過的夏天的夜晚，習習涼風，吹起夏蟲鳴，草木香，催發人世好夢。

2.3.2 酶負載量對生物傳感器響應的影響

酶的負載量也是影響電極性能的主要因素，考察了不同的AChE負載量對氧化峰電流的影響。如圖6(b)所示，隨著酶修飾量由0.04U增加至0.06U，氧化峰電流值也隨之增大，但當AChE的量再增大，氧化峰電流值略有降低，這可能是由于過多的AChE會造成酶活性位點的相互遮蓋，影響酶的活性，因此后續試驗選擇酶的負載量為0.06U。

2.3.3 Pt-Pd/MoS2的修飾量對生物傳感器響應的影響

考察在電極上修飾不同質量的Pt-Pd/MoS2（0.25～1.25μg）對氧化峰電流值的影響。如圖6(c)所示，在Pt-Pd/MoS2的修飾量從0.25μg增大至0.75μg時，氧化峰電流值不斷增大，Pt-Pd/MoS2的修飾量再增大，氧化峰電流值不再增大反而略有降低，這是由于Pt-Pd/MoS2具有良好的導電能力，修飾適量的Pt-Pd/MoS2納米復合物，尤其是納米材料形成單層膜的情況下，會使傳感器達到最大的靈敏度，但Pt-Pd/MoS2的修飾量過大時，會在電極的表面形成不均勻的雙層或多層膜，對電子傳遞產生阻礙。因此后續試驗選擇Pt-Pd/MoS2的修飾量為0.75μg。

圖6 試驗條件的優化

2.3.4 農藥抑制時間的影響

電極在OPs中的抑制時間是影響抑制率的重要因素，因此，將電極在馬拉硫磷的溶液中抑制不同時間，考察其對抑制率的影響。如圖6(d)所示，抑制時間為100～400s時，抑制率不斷增大，繼續增大抑制時間，抑制率無明顯的變化，表明此時馬拉硫磷與AChE的結合狀態已達到飽和[17-19]。后續試驗選擇400s為抑制時間。

2.4 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在ATCl中的計時電流響應

圖7是AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的時間電流工作曲線。試驗條件是在持續磁力攪拌的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）的溶液中，工作電壓0.65V下，每隔50s加入不同濃度的ATCl。由圖7可知，隨著溶液濃度的不斷增加，電流值呈階梯狀不斷增大，且在5s左右達到穩定，說明AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE對ATCl具有良好的響應性，且ATCl的濃度在100～3200μmol/L范圍內與電流大小呈現線性關系，且當ATCl的濃度為3200μmol/L后，響應電流值趨于穩定，這符合典型的米氏過程，根據L-B方程，ATCl濃度與電流值的雙倒數作圖可以計算得出表觀米氏常數［圖7(b)］，AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE傳感器上AChE的Km為883μmol/L。

圖7 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的時間電流曲線

2.5 馬拉硫磷和甲基對硫磷的檢測范圍

圖8 制備電極在不同濃度的馬拉硫磷和甲基對硫磷抑制400s后的DPV圖

表1 Pt-Pd/MoS2對馬拉硫磷的檢測性能與相關文獻的比較

2.6 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在實際樣品中農藥回收率的測定

考察AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE在卷心菜中的馬拉硫磷和甲基對硫磷兩種農藥的回收率，見表2所示。AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE傳感器對于卷心菜中的有機磷農藥的檢測回收率為91.4%～103%，相對標準偏差為1.9%～4.5%。研究結果表明該生物傳感器具有較好的回收率和準確性，可用于實際樣品的分析。

表2 實際樣品中OPs的回收試驗（n=3）

2.7 AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE的選擇性

圖9 不同干擾物對測定馬拉硫磷氧化峰電流值的影響

2.8 儲藏穩定性和重現性

將制備好的電極儲藏在4℃的干燥環境中，每隔一段時間測量在含有1mmol/L ATCl的0.1mol/L PBS（pH 7.5）中的DPV曲線。試驗結果表明，儲藏38天后仍能保持90%以上的初始響應電流值，顯示了良好的儲藏穩定性，電流值在長時間儲藏后有一定程度的降低，可能是儲藏過程中酶活力降低導致的。

用同樣的制備方法制備6支電極，分別測量在1×10-10mol/L的馬拉硫磷溶液中抑制10min后，在含有1mmol/L ATCl的PBS（0.1mol/L，pH=7.5）中的DPV曲線，相對標準偏差為4.69%；并對同一支電極在1×10-10mol/L的馬拉硫磷有機農藥抑制10min后，在1mmol/L的ATCl中重復測定8次的DPV曲線，相對標準偏差為4.58%，表明AChE/Pt-Pd/MoS2/GCE具有良好的重現性。

3 結論

利用Pt-Pd/MoS2在玻碳電極表面固定AChE，制備了AChE生物傳感器，當酶負載量為0.06U、Pt-Pd/MoS2的修飾量為0.75μg、緩沖溶液pH為7.5時，生物傳感器具有較好的響應性。測定動力學參數Km為883μmol/L；并以馬拉硫磷和甲基對硫磷為代表，研究了制備電極的檢測性能，馬拉硫磷的檢測 范 圍 為1×10-14～1×10-5mol/L，檢 測 限 為4.69×10-14mol/L；甲基對硫磷的檢測范圍為1×10-15～1×10-5mol/L，檢測限為5.23×10-15mol/L（S/N=3）。同時電極具有良好的抗干擾性、儲藏穩定性和重現性。貴金屬納米顆粒和MoS2納米片的結合，一方面貴金屬納米顆粒為本來就具有邊緣活性的MoS2納米片材料提供了更豐富的活性位點，同時增大了比表面積；另一方面，MoS2納米片具有的二維穩定的結構，可以在保證發揮高效的電化學活性的同時降低貴金屬的用量，降低生產成本，為二維納米材料構建高效生物傳感器提供了思路，其應用范圍可以拓展到傳感器制備和電催化等領域。