Apelin-13對肝細胞癌HepG2細胞增殖的影響

何寶鳳， 雷俊悅， 曾 奎， 陳雄英， 黃秋林

(南華大學附屬第一醫院胃腸外科，湖南省衡陽市 421001)

原發性肝癌是全球發病率第六位及癌癥相關死亡率第四位的癌癥[1]。Apelin在體內分布廣泛，在右心房、左心室、腦、肺、肝和腎上腺中均可檢測到Apelin的表達，尤其在血管內皮細胞中高表達[2]。Apelin可通過旁分泌的形式介導腫瘤新生血管的生成，Picault等[3]報道了Apelin信號通過激活自分泌參與結腸腺癌的生長。 Apelin家族包括多種亞型，焦谷氨酸修飾形式的Apelin-13是其中生物活性最強的一種。Apelin-13與部分腫瘤的生長侵襲轉移密切相關[4-5]。Apelin在肝癌中表達上調，以自分泌的形式通過PI3K/Akt通路促進肝癌的進展[6]。本研究以不同濃度Apelin-13處理肝細胞癌HepG2細胞不同時間，觀察其對HepG2細胞增殖的影響，以研究其在肝癌發展中的影響及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌細胞HepG2購自中科院上海細胞研究所；Aeplin-13購自Santa公司；抗-CyclinD1抗體、抗-Caspase-3抗體購自ABZOOM公司；MTT試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠試劑盒購自博士德生物科技有限公司。

1.2 細胞培養

人肝癌HepG2細胞37 ℃、5%CO2培養箱中培養，顯微鏡下觀察到約90%細胞覆蓋培養板后，用胰酶消化并吹打成懸液。接種于96孔板中，約5×103/孔。待細胞覆蓋率約50%時，予細胞換液，加入不含10%FBS的培養基，放入培養箱繼續培養12 h備用。

1.3 細胞分組

根據本課題組前期的研究[7]，按不同濃度的Aeplin-13分為5組：10%FBS(對照組)、0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組，處理時間為24 h；每組設3個復孔。再根據初步的實驗結果，選用差異最大的Apelin-13濃度(0.1 μmol/L)處理不同時間：0 h(對照組)、6、12、18、24 h組。具體方法：將上述處理后的各組細胞加入0.1 mL含10%FBS的培養基，24 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，開始計時，6 h后18 h組加入0.1 μmol/L Apelin-13，以此類推，對照組不加入Apelin-13，37 ℃培養箱中培養24 h。

1.4 MTT檢測HepG2細胞增殖

細胞分組后，每個孔各加入20 μL 0.5%MTT(5 g/L)，培養箱內放置4 h，然后吸取丟棄原培養液加入150 μL DMSO，振蕩10 min后在酶聯免疫檢測儀上測量各孔在490 nm處的吸光值。每組設5個復孔。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

各組細胞裂解30 min，4 ℃離心8 min(12 000 r/min)，收集上清液。采用BCA試劑盒進行HepG2細胞蛋白定量，將蛋白量調制等量后，加入上樣緩沖液，加熱至99 ℃ 10 min，冷卻至4 ℃ 4 min，然后置于-20 ℃冰箱內保存備用。將制備好的1.0 mm厚度的10%SDS-PAGE凝膠置于電泳緩沖液中上樣(每孔20 μL蛋白樣品)，電轉移至硝酸纖維素膜后使用5%封閉液封閉2 h。封閉結束后，加入稀釋號的一抗孵育過夜(抗體效價為1∶250)，TBST洗膜3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(抗體效價為1∶1 000)，搖床上孵育60 min，TBST洗膜3次，10 min/次。將增強劑、穩定劑、背景抑制劑按照20∶20∶1的比例混合，加至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，孵育5 min后顯影。Mias圖像分析系統測定各條帶灰度值,與β微管蛋白(β-Tubulin)條帶光密度值之比反映蛋白的表達。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 不同濃度Apelin-13在不同時間對HepG2細胞增殖的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的OD值增加(P<0.05；圖1)，且OD值隨著Apelin-13濃度增加而增加，Apelin-13呈濃度依賴性促進細胞增殖。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，OD值隨著Apelin-13處理時間的增加而增加(P<0.05；圖2)，Apelin-13呈時間依賴性促進細胞增殖。

圖1 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞增殖的影響

圖2 0.1 μmol/L的Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞增殖的影響

2.2 不同濃度Apelin-13及不同時間對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的CyclinD1表達升高，且隨濃度升高呈遞增趨勢(P<0.05；圖3)。用0.1 μmol/L的Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，CyclinD1表達隨Apelin-13處理時間延長呈遞增趨勢(P<0.05；圖4)。

圖3 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

圖4 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞中CyclinD1表達的影響

2.3 不同濃度Apelin-13及不同時間對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

與對照組比較，0.000 1、0.001、0.01、0.1 μmol/L組的Caspase-3表達降低，且Caspase-3表達隨濃度的增高而降低(P<0.05；圖5)。用0.1 μmol/L Apelin-13處理HepG2細胞不同時間后，Caspase-3的表達隨處理時間延長而降低(P<0.05；圖6)。

圖5 不同濃度Apelin-13對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

圖6 0.1 μmol/L Apelin-13處理不同時間對HepG2細胞中Caspase-3表達的影響

3 討 論

Apelin是從牛胃分泌物中提取的孤兒G蛋白偶聯受體的天然配體。Apelin/APJ在體內分布廣泛，作為血管活性肽的Apelin以內分泌、旁/自分泌等方式在調節心血管系統穩態方面的生物學效應成為了研究熱點[8]。Apelin-13作為具有最高的生物學活性的Apelin亞型，參與了多種重要的生物學過程。Peng等[5]發現Apelin-13可通過ERK1/2/AIB1信號通路促進乳腺癌MCF-7細胞增殖和侵襲。Apelin-13能促進肺腺癌細胞增殖，同時通過PAK1-cofilin磷酸化機制介導了Apelin-13促進肺腺癌細胞遷移[4]。

筆者通過體外培養肝癌HepG2細胞，研究不同濃度及不同作用時間的Apelin-13對HepG2細胞增殖的影響。結果表明，在一定范圍內隨著Apelin-13濃度增加和處理時間的延長，HepG2細胞增殖能力增加，證實外源性Apelin-13可促進HepG2細胞增殖，這與Chen等[9]在結腸癌中Apelin-13對結腸癌細胞作用結果一致。同時本文利用Western blot檢測Apelin-13作用下HepG2細胞增殖相關蛋白CyclinD1的表達水平。細胞在正常生理狀態下由G1期進入S期后，細胞內的CyclinD1會迅速分解，一旦CyclinD1持續高表達，就會使細胞的G1期縮短，使細胞周期變化，提前進入S期，導致細胞增殖失控，這也是腫瘤的發生機制之一。本研究結果顯示，隨著Apelin-13濃度升高和作用時間延長，CyclinD1表達也隨之增高。Caspase-3是包括凋亡在內的多種生物學過程中的關鍵酶。本研究結果顯示，隨著Apelin-13濃度的增高和處理時間的延長，Caspase-3的表達也隨之降低，提示Apelin-13可呈濃度和時間依賴性抑制HepG2細胞Caspase-3的表達，從蛋白水平進一步證實其能抑制HepG2細胞凋亡。有研究表明，Caspase-3在肝癌組織中表達增高，并與肝癌細胞凋亡有關[10]。結合本研究結果，Apelin-13可能通過抑制肝癌細胞的凋亡而促進腫瘤進展。Lu等[11]發現Apelin-13可通過相應的機制來促進視網膜膠質細胞的增殖，并能抑制其凋亡。前期研究發現Apelin-13可通過激活ERK1/2信號通路，上調HepG2細胞Beclin1的表達促進細胞自噬[7]，該機制是否與增殖和凋亡有關有待進一步證實。

本實驗研究表明，Apelin-13是參與肝癌細胞增殖的新分子，且可抑制Caspase-3蛋白的表達，對探尋肝癌發生發展機制具有重要意義，有望成為肝癌一個新的分子治療靶點。