高特異性心肌肌鈣蛋白I適配體的ePCR技術篩選及其表征

岑 怡， 王仲萍， 柯培雄， 袁中文， 劉曉敏， 嚴鵬科

(1.廣州醫科大學附屬第三醫院藥學部，廣東省廣州市510150； 2.廣州同鵬中旭醫藥科技有限公司，廣東省廣州市510000；3.廣州醫科大學藥理學系，廣東省廣州市511436)

急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)是在冠狀動脈粥樣硬化的基礎上因斑塊破裂阻塞引起局部缺血而導致的心肌壞死，是全世界范圍內死亡率最高的疾病之一[1]。目前，心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)因僅在心肌中產生，并且對心臟損傷顯示出高度特異性而成為了診斷AMI的金標準[2]。

適配體是一種單鏈DNA或RNA，因與靶標物質的親和力高且特異性強的優點，正被廣泛用于疾病的診斷和治療研究中[3]。PCR作為一種體外擴增DNA技術，已廣泛用于多種研究領域[4]。但普通PCR易使DNA模板污染且容易產生非特異性片段，因此需要建立一種乳液PCR(emulsion PCR,ePCR)以改善普通PCR的不足。目前臨床上檢測cTnI多依賴于抗體技術，但床旁檢測對時效性和精密度要求較高，而抗體在制備過程中容易產生批間差異導致檢測精密度降低。多克隆抗體容易產生非特異性，單克隆抗體又容易丟失結合靶位，因此希望通過適配體技術以彌補抗體在臨床檢測上的不足并提高檢測水平。

本實驗通過基于ePCR的指數富集配體系統進化技術(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)，從隨機寡核苷酸文庫中篩選出與cTnI特異性結合的核酸適配體。對篩選得到的適配體進行親和力檢測并與市售的cTnI抗體進行比較，以期取代傳統的抗體檢測技術，為AMI的早期診斷提供一種新的手段。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

96 bp核酸序列及其引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；cTnI、心肌肌鈣蛋白C(cTnC)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、人血清蛋白(HSA)(武漢云克隆公司)；鏈酶親和素磁珠(美國Promega公司)；DNA純化試劑盒(Plus DNA Clean/Extraction Kit DP034P)；96孔酶標板(美國康寧公司)；肌鈣蛋白I抗體(重慶探生科技有限公司)；辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(北京博奧森生物技術有限公司)；TMB顯色液、ELISA終止液(北京索萊寶公司)；其他化學試劑均為國產分析純產品。恒溫水浴箱(上海一恒科技有限公司)；PCR儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；垂直凝膠電泳儀、凝膠成像系統、多功能酶標儀(美國Biotek公司)。

1.2 SELEX篩選過程

以cTnI為正篩蛋白，HSA為反篩蛋白，采用生物素-親和素系統將長度為96 bp的隨機ssDNA(700 pmol)固定在磁珠上，然后加入250 μg cTnI與磁珠混合后于37 ℃恒溫水浴箱中振蕩孵育1 h；能與蛋白結合的DNA會被拖拽至溶液中，不與蛋白結合的DNA仍吸附在磁珠上。將正篩(或反篩)后留下的DNA用酚氯仿法提取后進行ePCR擴增，純化后ePCR產物與鏈酶親和素磁珠在37 ℃中孵育30 min，PBS洗滌3次后加入300 μL 100 mmol/L NaCl和50 mmol/L NaOH混合溶液，使雙鏈DNA變性解鏈獲得單鏈DNA后再進行下一輪篩選，直到第9輪正/反篩后得到了與cTnI特異性結合的富集ssDNA[5]。SELEX篩選過程如圖1所示。

圖1 SELEX篩選過程流程圖

1.3 ePCR條件優化

油相部分：礦物油5 mL，Span80 450 μL，Tween80 40 μL，TritonX-100 5 μL后加礦物油至10 mL，旋渦混勻。水相部分：2×TaqMix 500 μL，上游引物(5′-CGT ACG GTC GAC GCT AGC-3′)和下游引物(5′-Biotin-GGA TCC GAG CTC CAC GTG-3′)各20 μL，加純化水440 μL。取20 μL 1 μmol/L模板DNA加到水相中后緩慢滴入油相(水相∶油相為1∶2)，直至油相和水相混合成白色乳液狀后再進行擴增。普通PCR則無油相，僅將上述水相部分配制成反應混合液后進行擴增。PCR擴增條件：在變性94 ℃，退火70/72 ℃，延伸70 ℃，總延伸時間為15 min的條件下，做25/30個循環。每輪對退火溫度和循環輪數進行優化，用10%變性聚丙烯酰胺凝膠檢測擴增產物，直至擴增條帶清晰單一，無非特異性擴增為止。

1.4 ePCR產物的純化和克隆測序

將ePCR擴增得到的產物9 000 r/min離心10 min，除去上層油相；加入2倍體積的乙醚混勻后9 000 r/min離心1 min(重復3次)，然后用2.5倍體積的無水乙醇和1/10體積的3 mol/L醋酸鈉沉淀DNA。使用DNA純化回收試劑盒沉淀得到的DNA進行純化后測定其含量，短期內4 ℃保存。

由深圳華大基因科技有限公司進行克隆與測序。

1.5 ELONA法測定適配體親和力

以市售抗體為陽性對照，包被液(pH9.6 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)稀釋cTnI至5 mg/L，于96孔酶標板100 μL/孔4 ℃孵育過夜；次日棄去孔內液體，用封閉液(3%BSA)室溫封閉1 h，然后棄封閉液，用洗滌液(0.01%TBST)洗板3次；加入梯度濃度生物素標記的適配體100 μL，37 ℃溫育1 h后洗滌3次；每孔加100 μL辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(1∶10 000)37 ℃溫育30 min后洗板5次；每孔加100 μL TMB顯色液避光反應15 min后加入50 μL終止液終止反應，在10 min內采用全波長熒光酶標儀測定450 nm處光密度值。

1.6 ELONA法測定適配體特異性和敏感性

以市售抗體為陽性對照，分別于96孔板中加入低(1 mg/L)、中(2 mg/L)、高(4 mg/L)3種質量濃度的cTnI/cTnC/cTnT/HSA各100 μL，4 ℃孵育過夜；于96孔板中加入等量低(1 mg/L)、高(4 mg/L)質量濃度的cTnI+cTnC/cTnT/HSA 100 μL混合溶液，4 ℃孵育過夜。第2天加100 μL 50 nmol/L適配體進行結合孵育，其余操作步驟同1.5方法。

1.7 統計學方法

2 結 果

2.1 SELEX篩選及ePCR條件的優化

采用磁珠SELEX法將修飾生物素的DNA序列固定在鏈霉親和素磁珠上，加入的蛋白可將與之結合的DNA從磁珠上拉至溶液中，然后將DNA從溶液中分離出來進行PCR擴增。PCR擴增獲得特異性產物是適配體篩選成功的關鍵，本實驗采用的ePCR是PCR的一種新型變體，將每個寡核苷酸序列封裝到由疏水有機相包圍的單個PCR微滴中，可顯著降低PCR偏差并減少非特異性。實驗中對每輪PCR擴增的退火溫度、循環次數、模板量都進行優化，并用10%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳驗證。如圖2所示，采用ePCR進行擴增時，當變性溫度94 ℃，退火溫度70 ℃，延伸溫度70 ℃，總延伸時間為15 min時，做25個循環，條帶單一且無非特異性條帶；而普通PCR在同等條件下均出現了不同程度非特異性條帶。將PCR產物與標記鏈霉親和素的磁珠結合后用NaOH裂解能得到穩定的單鏈DNA次級文庫。隨著篩選輪數的增加，得到具有高特異性且有較強親和力的cTnI適配體。

圖2 PAGE觀察PCR擴增條件的優化

2.2 適配體親和力檢測

經9輪SELEX篩選后再測序得到的適配體序列和對應解離平衡常數見表1。解離常數Kd值越小，則代表親和力越高。結果顯示，篩選得到的3個適配體均對cTnI的親和力強度達到納摩爾級別。其中，Apt-1與其他適配體相比親和力最高[Kd為(2.04±0.11) nmol/L]，且優于市售的抗體[Kd為(3.19±0.53) nmol/L]。Apt-1的量效曲線見圖3，用Mfold軟件對其進行二級結構模擬分析結果見圖4。

表1 適配體序列及其與cTnI親和力

圖3 適配體Apt-1的量效曲線圖

圖4 適配體Apt-1二級結構模擬圖

2.3 適配體特異性和敏感性檢測

在特異性考察中，以市售cTnI抗體(Ab)為陽性對照，分別檢測適配體對低、中、高3種質量濃度cTnI/cTnC/cTnT/HSA的結合能力，通過方差分析發現Apt-1僅對cTnI有特異性，與其他相關蛋白沒有結合(P<0.05；圖5A)。于低、高兩種質量濃度的cTnI中加入等量的cTnC/cTnT/HSA制備混合溶液進行檢測干擾，同樣發現相關物質的加入并不影響Apt-1對cTnI的特異性識別(圖5B)。在相同質量濃度下，Apt-1檢測cTnI的光密度值較市售抗體高，說明本實驗室篩選得到的適配體敏感性更高(圖5)。

圖5 適配體Apt-1與不同質量濃度cTnI的特異性和敏感性比較

3 討 論

通過SELEX篩選技術得到的幾乎所有適配體均顯示對目標分子的高親和力，其解離常數(Kd)在微摩爾至納摩爾范圍內，因此適配體也有“化學抗體”之稱。到目前為止，已有數個適配體正參與臨床試驗。輝瑞公司的哌加他尼鈉注射液(商品名Macugen)作為抗血管內皮生長因子的RNA適配體已被美國FDA批準用于治療年齡相關的黃斑退化病，從而預防新血管生成[6]。除臨床治療外，適配體還用于許多其他應用，例如檢測COVID-19病毒和細菌感染，檢測癌癥生物標志物，檢測環境污染檢測和在生物傳感器上應用[7-11]。SELEX篩選技術首次應用以來至今已經歷了無數的變化和改進，其中改進對每輪篩選得到的DNA序列進行擴增的方法也是一個重要環節[3]。由于初始文庫中的每個序列具有不同的結構特性，因此它們對DNA聚合酶、引物和PCR條件的適應性可能會大不相同[12]。這導致了PCR副產物的產生并傾向于篩選出適應該PCR條件的適配體而不是與靶分子最具高親和力的適配體。本實驗采用的ePCR將DNA序列包裹在有機相中形成一個個乳滴，構成了數目龐大的獨立PCR反應空間，使得DNA在擴增過程中相對獨立而不被干擾。該方法的優勢在于減少了非特異性產物的生成，產物量比普通PCR多，同時解決了普通PCR優先擴增短鏈DNA片段的問題。這為篩選出高親和力和高特異性的適配體提供了極大優勢。

目前臨床上多采用基于抗原抗體反應設計的檢測試劑盒進行cTnI的測定，但抗體在生產過程中難免產生批間差異，從而導致檢測結果不一致[13]。此外，抗原在不同個體中的免疫原性不同，導致在臨床檢測中擁有同樣表達水平的病人檢測結果不同。適配體作為一小段核苷酸序列，可以穩定合成且不產生免疫原性。同時，適配體生產周期短，可在兩個月甚至兩周內就可篩選出針對不同分子的特異性適配體；其制備原材料成本也比抗體更低，在經濟學上更具時間成本效益。在本實驗中，通過ELONA法測定了適配體的親和力，最終得到了Kd值最小的適配體Apt-1。Kd值越小證明其親和力越高，代表著當適配體質量濃度較低時也能與靶分子形成穩定復合物。將Apt-1與市售抗體相比，發現該適配體的親和力更強。進一步測定適配體Apt-1的特異性和敏感性，結果發現該適配體對cTnI具有極高的特異性，未發現與其他相關蛋白有非特異性結合；在檢測相同質量濃度cTnI時，適配體的光密度值較抗體大，可認為該適配體對靶蛋白的敏感性更強。故本實驗中篩選出來的適配體能有效應用于樣本中cTnI的檢測。以上結果均表明適配體在取代傳統抗體成為一種新的診斷AMI技術中具有極大優勢。

如今，適配體作為傳統抗體的核酸類似物，在生物醫學領域中扮演著重要的角色。適配體的潛在價值不可忽視，隨著相關研究的不斷深入，將會有更多的適配體問世，未來必定在基礎研究和臨床診斷治療中擁有廣泛的應用。