缺氧通過HIF-1α/PCSK9信號途徑誘導神經細胞凋亡

劉錄山， 鄧懿銘， 李 清

(1.南華大學心血管疾病研究所 動脈硬化學湖南省重點實驗室 湖南省動脈硬化性疾病國際科技合作與創新聯合實驗室，湖南省衡陽市 421001；2.湖南環境生物職業技術學院病理學教研室，湖南省衡陽市 421001)

缺血缺氧性腦損傷通常由腦組織出現急性或慢性的局部或完全缺氧所導致，臨床上以新生兒窒息引起的腦損傷多見[1]，是引起神經系統損傷的主要原因，在此過程中神經細胞凋亡起著重要角色[2]。

缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor,HIF-1α)是一類真核細胞轉錄因子，在細胞處于低氧狀態時其表達水平升高以應激性地對抗內環境改變[3-4]。研究表明前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9,PCSK9)與神經細胞凋亡存在相關性[5]。本課題研究缺氧是否通過調節HIF-1α表達上調PCSK9水平引起神經細胞凋亡，旨在為缺血缺氧性損傷的防治提供潛在的治療靶點。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PC12細胞購自中科院上海細胞庫；氯化鈷(CoCl2)購于美國西格瑪公司；DMEM培養基購于美國Hyclone公司；ECL化學發光檢測試劑盒購自湖南艾佳生物科技公司；胎牛血清購自天津市灝洋生物制品公司；Hoechst 33258染色劑購自江蘇碧云天生物有限公司；PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9、β-actin兔抗人多克隆抗體均購自Proteintech公司；Lip 2000轉染試劑、臺盼藍染色液購自北京索萊寶公司；缺氧誘導因子抑制劑利非西呱(YC-1)、缺氧誘導因子激動劑二甲基乙二酰基甘氨酸(DMOG)購自美國Selleck公司；PCSK9小干擾RNA(PCSK9 small interfering RNA,PCSK9 siRNA)購自吉凱基因。倒置光學顯微鏡購自日本Olympus公司；倒置熒光顯微鏡購自日本尼康公司；化學發光成像系統購自上海天能公司；凝膠電泳系統購自美國BIO-RAD公司；Aria Ⅱ流式細胞儀購自美國BD公司。

1.2 細胞培養及分組

PC12細胞于含有10%胎牛血清及1%青/鏈霉素的DMEM培養基中，37 ℃，5%CO2條件下培養。2～3天定期更換培養基，融合度70%～80%進行傳代。使用不同濃度CoCl2(0、125、250、500 μmol/L)孵育PC12細胞24 h并觀察CoCl2對PC12細胞的影響；使用不同濃度DMOG(0、250、500、1 000 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細胞24 h并觀察DMOG對PC12細胞的影響；使用不同濃度YC-1(0、1、10、50 μmol/L)與250 μmol/L CoCl2共孵育PC12細胞24 h并觀察YC-1對PC12細胞的影響。細胞轉染實驗中，無義RNA組為siCtrl+250 μmol/L CoCl2，PCSK9 siRNA組為siPCSK9+250 μmol/L CoCl2。

1.3 蛋白印跡分析

對各個分組中的PC12細胞分別進行處理后提取總蛋白，在培養瓶中加入RIPA裂解液充分作用，采用BCA法進行蛋白含量測定，取含有30 μg蛋白的樣本進行蛋白印跡法檢測，電泳后電轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下作用2 h，4 ℃孵育1∶1 000稀釋的PCSK9、HIF-1α、Caspase-3、Caspase-9一抗或1∶5 000稀釋的β-actin一抗過夜，洗膜3次后室溫孵育1∶2 000稀釋的二抗1 h，ECL化學發光法得到條帶并計算蛋白相對表達水平。

1.4 Hoechst 33258核染色檢測細胞凋亡

PC12細胞分別進行處理后，以1×PBS潤洗細胞3次，4%多聚甲醛固定30 min，蒸餾水潤洗3次，10 min/次，每孔加入Hoechst 33258染液于避光條件下作用25 min，蒸餾水潤洗3次，10 min/次。甘油封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Annexin V-FITC/PI染色

處理各組PC12細胞后，0.25%的胰酶1 mL消化適度后終止，吹打混勻后離心1 000 r/min 10 min，收集細胞并以1×Binding Buffer重懸，離心2 000 r/min 5 min，洗滌。1×Binding Buffer再次重懸，離心2 000 r/min 5 min后再次加入緩沖液重懸混勻后繼續加5 μL Annexin V-FITC進行染色，于常溫下孵育15 min后再補入5 μL PI與200 μL緩沖液后使用流式細胞儀進行檢測并計數。

1.6 細胞轉染

PC12細胞接種于24孔板中待融合度達30%～50%后轉染，通過脂質體Lip2000使無義siRNA與PCSK9 siRNA分別轉染PC12細胞，并分別標記為無義RNA組與PCSK9 siRNA組，37 ℃培養箱中轉染48 h后檢測轉染效率。PCSK9 siRNA正義鏈為5′-GGAGGAUAGCCUGGUUGAUdTdT-3′，反義鏈為3′-d Td TCCUCCUAUCGGACCAACUA-5′；陰性對照siRNA由吉凱基因公司提供。

1.7 統計分析

2 結 果

2.1 CoCl2對PC12細胞中HIF-1α和PCSK9表達的影響

與0 μmol/L CoCl2組比較，其他CoCl2處理組HIF-1α和PCSK9表達升高且隨CoCl2濃度的增加呈遞增趨勢(圖1)。用250 μmol/L CoCl2處理PC12細胞0、6、12、24 h，隨著處理時間延長，HIF-1α和PCSK9表達呈遞增趨勢(圖1)。

圖1 不同濃度或不同時間CoCl2處理PC12細胞對HIF-1α及PCSK9表達影響

2.2 CoCl2呈濃度依賴性促進PC12細胞的凋亡

結果顯示隨著CoCl2濃度的增高，與核染劑Hoechst33258結合而呈致密濃染或呈碎塊狀致密濃染區域逐漸增多；流式細胞術檢測顯示凋亡率也隨之遞增(圖2)。

圖2 CoCl2呈濃度依賴性促進PC12細胞的凋亡

2.3 DMOG對PC12細胞HIF-1α、PCSK9表達以及凋亡的影響

各濃度組DMOG均能在CoCl2誘導的低氧狀態下上調PC12細胞中HIF-1α、PCSK9的表達并下調Caspase-3、Caspase-9的表達(圖3)。Hoechst33258染色結果及流式細胞術檢測結果顯示，DMOG呈濃度依賴性抑制CoCl2導致的PC12凋亡(圖4)。

圖3 DMOG對PC12細胞HIF-1α和PCSK9表達以及凋亡的影響

圖4 DMOG呈濃度依賴性降低PC12細胞凋亡水平

2.4 YC-1對PC12細胞PCSK9、HIF-1α表達以及PC12細胞凋亡的影響

各濃度組YC-1均能在CoCl2誘導的低氧狀態下下調PC12細胞中PCSK9、HIF-1α的表達并上調Caspase-3、Caspase-9的表達且表現出濃度依賴性(圖5)。Hoechst33258染色結果及流式細胞術檢測結果顯示，YC-1呈濃度依賴性促進PC12凋亡(圖6)。

圖5 不同濃度HIF-1α抑制劑YC-1對PC12細胞HIF-1α、PCSK9及凋亡相關蛋白表達的影響

圖6 YC-1呈濃度依賴性增加PC12細胞凋亡水平

2.5 PCSK9 siRNA轉染結果鑒定

與空白組及無義RNA組比較，siPCSK9組基因表達顯著下調，證明轉染效率較高，轉染成功(圖7)。

圖7 PCSK9 siRNA有效降低了PC12細胞中PCSK9表達(n=3)

2.6 PCSK9 siRNA轉染對PC12細胞凋亡的影響

為進一步探究PCSK9在CoCl2誘導的PC12細胞凋亡中的作用，進行如下分組：空白對照組；250 μmol/L CoCl2組；250 μmol/L CoCl2+無義RNA組；250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組。Western blot檢測顯示，與無義RNA組比較，250 μmol/L CoCl2+PCSK9 siRNA組PCSK9表達降低且Caspase-3、Caspase-9表達均減少(圖8)。Hoechst33258熒光染色及流式細胞術檢測結果顯示，干擾PCSK9表達可降低CoCl2導致的PC12凋亡(圖9)。

圖8 PCSK9 siRNA對CoCl2誘導的PC12細胞中PCSK9及凋亡相關蛋白表達的影響

圖9 PCSK9 siRNA下調PC12細胞凋亡水平

3 討 論

心腦血管疾病等慢性病引起的慢性缺血缺氧仍是目前一大難題。課題組前期研究發現oxLDL促使PC12細胞凋亡是PCSK9通過Bcl-2/Bax-Caspase-9/3信號通路所誘導[6]，提示PCSK9具有促神經細胞凋亡的作用。

HIF-1是一類細胞缺氧相關轉錄因子，細胞低氧應激下其表達上調可激活多條相關通路，但其在缺氧損傷中的作用及機制仍具有爭議性[7-8]，細胞種屬特異性及濃度相關的雙向性調節可能是其原因。

缺血缺氧性腦損傷發病機制復雜，氧化應激、谷氨酸興奮性神經毒性、炎癥、鈣超載等都是其中可能的分子機制，而神經細胞凋亡或壞死是其最終結果[9]。細胞凋亡是一種多基因嚴格控制的細胞自主性、有序性的死亡，正常水平的凋亡在調節細胞周期、維持內環境穩態及個體發育中有著重要意義，而既往神經學研究顯示神經細胞的加速凋亡是神經退行性變的重要原因。研究表明缺氧使神經細胞凋亡增加[10]，且缺氧能使神經細胞HIF-1α表達增加[8]。本研究中選用CoCl2作為細胞缺氧模擬劑對PC12進行缺氧干預[11]，進一步通過分級干預探究PCSK9與HIF-1α在神經細胞凋亡中的作用機制。結果表明：CoCl2處理下PC12細胞中PCSK9、HIF-1α以及細胞凋亡水平較對照組升高，PCSK9 siRNA轉染后，CoCl2處理下PC12細胞凋亡水平較轉染對照組下降，表明低氧狀態下PC12細胞凋亡水平升高，而HIF-1α介導的PCSK9表達上調是其潛在的分子機制。

綜上所述，CoCl2誘導的細胞缺氧狀態能上調PC12細胞凋亡水平，HIF-1α介導的PCSK9表達上調是其潛在分子機制。這為缺血缺氧性腦損傷的防治提供了分子生物學依據，為缺血缺氧性腦損傷的靶向防治提供更多思路。