TLK2促進人乳腺癌細胞系增殖、遷移和侵襲

熊玉圓，陳德杰，孟 琳，晏 珊

(湖北文理學院附屬醫院 襄陽市中心醫院，湖北 襄陽 441021)

乳腺癌(breast cancer)是發生于乳腺導管上皮的惡性腫瘤[1]。全球每年約208萬例新診斷病例，有62.6多萬例死亡病例[2]。Tousled樣激酶2(tousled like kinase 2,TLK2)是絲氨酸-蘇氨酸激酶家族成員之一，與各種生物體中的DNA復制、DNA修復、轉錄和染色質結構等有關[3]。TLK在人類惡性腫瘤進展中頻繁擴增，成為癌治療的潛在靶標[4]。例如，TLK2被鑒定為治療結直腸癌和膠質母細胞瘤的潛在生物標志物[3,5]。已有報道TLK2與乳腺癌風險增加相關聯[6]。Targetscan在線分析數據庫提示，TLK2和miR-622之間存在潛在的結合位點。本研究旨在探索TLK2在乳腺癌中的表達、TLK2對乳腺癌細胞惡性表型的影響及其相關機制。本研究初步證實了miR-622/TLK2軸參與調控HCC70細胞增殖、遷移和侵襲，為乳腺癌的診斷和治療提供了新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料：從接受腫瘤切除術的患者中收集52例乳腺癌患者的病理組織標本及鄰近組織，立即存儲在-80 ℃冰箱中。所有患者經術后組織病理檢查明確診斷。本研究獲得所有患者知情同意和襄陽市中心醫院研究倫理委員會批準(XY20180501009)。

1.1.2 細胞與試劑：人正常乳腺上皮細胞系(MCF-10A細胞)和乳腺癌細胞系(HCC70、MCF-7細胞)(中國科學院上海細胞生物學研究所)；miR-control、miR-622抑制劑、空載質粒、過表達TLK2質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；RPMI1640培養基、牛血清和青霉素/鏈霉素(上海碧云天生物技術有限公司)；LipofectamineTM3000、Trizol試劑(Invitrogen公司)；PrimeScript RT Master Mix Kit(TaKaRa Bio公司)；引物序列(Genecopoeia 公司)；CCK-8試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)；BrdU抗體、抗TLK2(Abcam公司)；辣根過氧化酶標記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；Transwell小室、脫脂牛奶、PVDF膜(Millipore公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒 (Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養和分組處理：將MCF-10A細胞和MCF-7細胞培養于含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640完全培養基中，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養箱培養，每2～3 d更換培養液。待細胞接近80%匯合時用0.25%胰蛋白酶消化傳代。將細胞接種于12孔板，每孔細胞為1×106個，分為3組：對照組細胞正常培養，過表達TLK2組及轉染miR-622抑制劑組。

1.2.2 免疫組織化學法檢測組織中TLK2的表達:臨床標本在10%甲醛中固定、包埋、脫蠟和水化。用1% H2O2阻斷內源性過氧化物5 min,PBS洗3次，免疫染色封閉液封閉1 h，之后用羊抗兔抗體(1∶200)孵育4 ℃過夜。PBS洗滌切片，然后用生物素標記的抗血清室溫下孵育1 h。再次洗滌切片，DAB著色1 min，蘇木精染色1 min，在顯微鏡下觀察。

1.2.3 RT-qPCR檢測TLK2 mRNA和miR-622的表達：利用Trizol試劑提取總RNA，然后使用轉錄試劑盒反轉錄為cDNA。采用SYBRGreen法，以cDNA為模板，利用miR-622和TLK2特異性引物進行PCR擴增。對每組樣品進行一式3份定量PCR檢測。使用2-ΔΔCt方法計算miR-622和TLK2 mRNA相對表達量。PCR進行的條件如下：95 ℃預變性5 min，然后在95 ℃下變性15 s，在60 ℃下退火30 s。引物序列如下：TLK2：5′-ACTAGCGCAAAGG AACTCAATGTG-3′ (上游引物)，5′-CCAGACCAG GCAAGACTCAGAC-3′ (下游引物)；miR-622:5′-ATCCCAGGGAGACAGAGATCGAGG-3′(上游引物),5′-AA GCTTGGTGGTGGACTTTTGGTTGT-3′ (下游引物)；GAPDH：5′-CTCCTCCACCTTTGACGCTG-3′ (上游引物),5′-TCCTCTTGTGCTCTTGCTGG-3′ (下游引物);U6:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′(上游引物),5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′(下游引物)。

1.2.4 Western blot檢測細胞中TLK2的表達：用RIPA提取MCF-10A、HCC70、MCF-7細胞中總蛋白。BCA法測定蛋白濃度后，采用SDS-PAGE分離總蛋白后轉至 PVDF 膜上。將膜用5%脫脂奶粉封閉1 h，4 ℃孵育一抗(1∶1 000)過夜。次晨采用TBST漂洗膜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶1 000)37 ℃孵育1 h，ECL顯影。

1.2.5 CCK-8法檢測HCC70細胞增殖：按照約2×103個細胞/孔接種于96孔板，培養1、2、3、4和5 d后取出，加入10 μL/孔CCK-8試劑后繼續孵育2 h。于酶標儀450 nm波長下檢測每孔吸光度值。

1.2.6 BrdU摻入實驗：將HCC70細胞(2×103個/mL)接種于24孔板中。當細胞匯合至80%時加入10 μmol/L BrdU。將細胞DNA經變性處理后加BrdU一抗(1∶300)，常溫孵育2 h。加入熒光二抗常溫孵育2 h，用DAPI復染細胞核后，在熒光顯微鏡下進行觀察。隨機選擇10個非重疊視野。計算BrdU陽性細胞數，取其平均值。

1.2.7 Transwell小室法評估HCC70細胞遷移和侵襲的能力：在侵襲實驗中，將Matrigel基質膠加入Transwell小室中。在Transwell小室上室加入含胎牛血清的培養基，下室加入含有胎牛血清的RPMI1640培養基。37 ℃繼續培養24 h后，甲醇固定下室中的細胞并用0.1%結晶紫染色，在倒置顯微鏡下拍照，顯微鏡下觀察穿膜細胞數，計數中間及四周5個高倍鏡下視野細胞數，計算平均數。遷移實驗，除在Transwell小室內未加入Matrigel外，其他步驟與侵襲實驗相同。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因實驗：將含有野生型及突變型TLK2的片段分別整合入pGL3 vector。將上述片段分別與miR-622模擬物或陰性對照物共轉染HCC70細胞。轉染48 h后，按照制造商的說明測定熒光素酶活性。所有實驗一式3份，重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 TLK2在乳腺癌組織和細胞中高表達

乳腺癌組織和癌旁組織免疫組化染色代表圖(圖1A)。癌旁組織中有31例陰性表達，21例陽性表達。乳腺癌組織中有19例陰性表達，33例陽性表達。統計結果提示TLK2在腫瘤組織中陽性率顯著增加(圖1B)(P<0.05)。GEPIA數據庫提示TLK2在乳腺癌中高表達(圖1C)。其次，與鄰近的非腫瘤組織相比，乳腺癌組織中TLK2 mRNA的表達顯著上調(圖1D)(P<0.001)。另外，與MCF-10A細胞相比，兩種乳腺癌細胞中TLK2在mRNA和蛋白水平也顯著上調(圖 1E，F)(P<0.05)。

A.immunohistochemical was used to detect the expression of TLK2 in breast cancer tissues and adjacent tissues (n=52);B.positive cases and negative cases of TLK2 expression in breast cancer tissues and adjacent tissues were counted;C.expression of TLK2 in breast cancer tissues and normal tissues was analyzed by GEPIA database;D,E.expression of TLK2 in breast cancer tissues (n=52)and cell lines (n=3)was detected by RT-qPCR;F.expression of TLK2 protein in the cell line was detected by Western blot (n=3);*P<0.01,**P<0.001 compared with control圖1 TLK2在乳腺癌組織和細胞中高表達Fig 1 TLK2 was highly expressed in breast cancer tissues and cells n=3)

2.2 TLK2促進HCC70細胞增殖、遷移和侵襲

隨后成功構建過表達TLK2細胞模型(圖2A)(P<0.001)。與對照組相比，過表達TLK2顯著促進HCC70細胞增殖(圖2B，C)(P<0.05)和遷移及侵襲(圖2D，E)(P<0.01)。

A.overexpressing TLK2 plasmid was successfully transfected into HCC70 cells;B,C.cell viability was detected by CCK-8 and BrdU assay(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell assay(×200);*P<0.05,**P<0.01；***P<0.001 compared with control圖2 TLK2促進HCC70細胞增殖、遷移和侵襲Fig 2 TLK2 promotes the proliferation,migration and invasion of HCC70 cells

2.3 miR-622在乳腺癌組織和細胞系中低表達

與癌旁組織相比，miR-622在乳腺癌組織中的表達水平下調(圖3A)(P<0.001)。此外與MCF-10A細胞相比，miR-622在乳腺癌細胞系中的表達水平顯著降低(圖3B)(P<0.05)。

A.expression level of miR-622 in breast cancer tissue was detected by RT-qPCR (n=52);B.expression of miR-622 in normal human breast epithelial cell lines and human breast cancer cell lines were detected by RT-qPCR(n=3);*P<0.05,**P<0.001 compared with control圖3 miR-622在乳腺癌組織和細胞中低表達Fig 3 Expression level of miR-622 in breast cancer was significantly reduced

2.4 抑制miR-622的表達顯著促進HCC70細胞增殖、遷移和侵襲

進一步將miR-con和miR-622抑制劑分別轉染HCC70細胞(圖4A)(P<0.001)。抑制miR-622的表達能顯著促進HCC70細胞增殖、遷移和侵襲(圖 4B～E)(P<0.05)。

A.miR-622 inhibitors were successfully transfected into HCC70 cells (n=3);B,C.cell proliferation was detected by CCK-8 and BrdU experiments(×100);D,E.migration and invasion were detected by Transwell experiments(×200);*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control圖4 miR-622抑制劑促進HCC70細胞增殖、遷移和侵襲Fig 4 miR-622 inhibitors promote HCC70 cell proliferation,migration and invasion

2.5 miR-622是TLK2的上游靶標

Targetscan分析表明miR-622和TLK2之間的結合位點(圖5A)。進一步，miR-622抑制劑能夠顯著促進TLK2在蛋白和mRNA水平的表達(圖5B,C)。進一一步，miR-622能夠顯著降低野生型TLK2的熒光素酶活性，但不能顯著降低突變型TLK2的熒光素酶活性(圖 5D)。此外，miR-622負向調控TLK2的表達水平(圖 5E)。

A.binding site between miR-622 and TLK2 was predicted by TargetScan;B,C.after breast cancer cells were transfected with miR-622 inhibitors,the expression level of TLK2 was detected by Western blot and RT-qPCR (n=3);D.interaction between miR-622 and TLK2 was verified by luciferase reporter gene (n=3);E.correlation between miR-622 and TLK2 expression level was analyzed by Pearson (n=52);*P<0.05,**P<0.001 compared with control圖5 miR-622靶向調控TLK2Fig 5 miR-622 targets and regulates TLK2

3 討論

TLK2不僅是許多生物體內維持基因組穩定和正常發育所必需的，而且與腫瘤的發生緊密相關[7]。例如，TLK2沉默導致細胞周期停滯在G2/M期，最終誘導膠質母細胞瘤細胞凋亡[3]。此外，TLK2通過激活下游的SRC從而促進膠質母細胞瘤細胞的惡性表型和上皮間質轉化[3]。TLK2沉默通過下調ERα、BCL2和SKP2，從而抑制乳腺癌細胞增殖，并誘導細胞凋亡[6]。TLK2的擴增和過度表達干擾Chk1/2誘導的DNA損傷檢查點信號，導致細胞周期G2/M檢查點異常，DNA修復過程延遲，染色體穩定性變差,從而誘導腫瘤的發生[8]。本研究中，TLK2在乳腺癌組織和細胞系中高表達，從而促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

miRNA是短鏈非編碼RNA，在惡性腫瘤進展中起著至關重要的作用，它通過與靶基因特異性結合在轉錄后水平調節腫瘤相關基因的表達[9]。已有報道指出miR-622參與抑制多種腫瘤進展。例如，miR-622的下調與神經膠質瘤的病理分級增高和總體生存率低有關。miR-622的過表達顯著抑制神經膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，同時在體外抑制ZEB2的表達從而促進細胞凋亡[9]。miR-622通過靶向CCL18抑制腎癌細胞的增殖和轉移[10]。miR-622通過靶向ING1、HIF-1α、MAP4K4、YAP1和RB1充當腫瘤的抑制因子，然而miR-622直接靶向DYRK2在結直腸癌中充當原癌基因[11]。這些研究表明miR-622產生的效應和腫瘤特異性有關。miR-622通過直接靶向RNF8 3′-UTR抑制RNF8表達，miR-622與乳腺癌之間存在潛在的相關性[12]。本研究結果表明，與對照組相比，轉染miR-622抑制劑后顯著促進乳腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，這提示miR-622在乳腺癌中發揮抑癌作用。通過生物信息學分析發現miR-622與TLK2之間存在結合位點。本研究發現與對照組相比，miR-622抑制劑顯著促進了TLK2在蛋白和mRNA水平的表達。進一步雙熒光素酶基因報告實驗結果提示miR-622可以結合TLK2的3′UTR。上述結果表明，miR-622/TLK2軸參與乳腺癌的進展。

總之，本研究發現TLK2作為促癌因子在乳腺癌組織及細胞中高表達。TLK2促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲。此外，miR-622是負向調控TLK2表達的上游分子。TLK2可能成為治療BC的新生物標志物。