哈爾濱地區不同泌乳階段母乳中低聚糖變化的研究

郭文奎，李博文，劉麗波

（1.東北農業大學食品學院，哈爾濱150030；2.東北農業大學乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱150030)

0 引 言

母乳是嬰兒成長過程當中最自然、最安全、最完整的天然食物，它含有嬰兒成長所需的所有營養。世界衛生組織建議，在嬰兒6個月前給予純母乳喂養，6個月到2歲或更長時間內，在繼續母乳喂養的同時添加輔食[1]。母乳中含有乳鐵蛋白、碳水化合物、蛋白質、脂肪、維生素、礦物質、脂肪酸和牛磺酸等眾多營養成分。而母乳的營養成分也會隨著產后母體的變化，以及哺乳的不同階段而發生變化。同時，母乳中會含有大量抗體，對嬰幼兒健康生長發育是非常重要的[2]。

母乳低聚糖（HMOs）是一類存在于人乳中的復雜混合低聚糖，是母乳中的重要成分之一，在母乳中含量為5～15 g/L，具有很高的生物活性。HMOs不僅具有獨特的益生元作用，可以影響嬰兒腸道菌群的構建，而且對嬰兒的大腦發育、抗感染、免疫調節以及體內信號傳導等都有十分重要的作用[3-4]。有研究表明，HMOs的含量和組成是隨著哺乳期時間變化而變化的。隨著哺乳時間的延長，母乳中HMOs的濃度逐漸下降。研究顯示在美國人群中，HMOs的濃度從哺乳期開始10天時的19.3 g/L降低至120天時的8.53 g/L[5-6]。

研究HMOs必須解決的關鍵問題是定性和定量的檢測方法。由于母乳中含有大量的脂肪和蛋白質，同時由于HMOs又是十分復雜的低聚糖混合物[7-8]，結構多樣，同時包含多個同分異構體，且沒有內在的發色團，使得HMOs的定性和定量檢測具有一定的難度[9-10]。要獲得HMOs的絕對含量，仍然需要標準品和標準曲線的方法。本試驗應用LC-MS建立快速、穩定、靈敏度高的檢測母乳中低聚糖定性及定量的方法，應用該方法分析不同哺乳期過程中各種低聚糖的變化情況。

1 實 驗

1.1 材料與試劑

1.1.1 母乳樣品采集

選擇黑龍江省哈爾濱地區哈爾濱醫科大學附屬第一醫院產科健康、足月生產、自愿捐獻的22～35歲母親，同時簽署知情同意書。在醫院期間取母乳時間為產后泌乳開始的第3、7天。出院后，樣品由母親產后到院檢查時收集，確保每月收集1次。收集單側全部乳汁并混勻后取其中5 mL至凍存管于-80℃冰箱凍存。本研究共收集63位母親的母乳樣品。

1.1.2 試劑

3'-fucosyllacos（3'-FL）、2'-fucosyllacose（2'-FL）、6'-siallyllactose（6'-SL）、3'-siallyllactose（3'-SL）、lacto-N-tetraose（LNT）、lacto-N-neotetraose（LNnT）、Lacto-N-fucopentaoseⅠ（LNFP-Ⅰ），美國Sigma-Aldrich公司；乙腈，美國Fisher公司。所用試劑均為色譜純。

1.2 儀器與設備

Waters TQ-S電噴霧質譜儀，Waters Acquity UPLC system，美國Waters公司；Eppendorf 5430R低溫高速離心機，德國Eppendorf公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，上海博迅實業有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

母乳樣品解凍后，取1 mL乳樣與1 mL純凈水混合均勻，震蕩1 min，冷凍離心機4 600 g離心10 min，用移液器除去上層脂肪，加入3 mL乙腈震蕩1 min，超聲10 min，冷凍離心機11 000 g離心10 min，重復兩次，去除沉淀蛋白，上清液為母乳低聚糖，經0.22μm膜過濾后進行HMOs組分檢測，并以HMOs標準品作對照外標定量分析。

1.3.2 色譜質譜條件

色譜柱：Inertsil Hilic柱(2.1 m×150 mm)；流動相：A液為乙腈，B液為50 mol/L乙酸銨溶液(p H 4.5)。樣品置于4℃自動進樣器中，柱溫40℃，流速400μL/min，進樣量5μL。梯度洗脫條件：95%流動相A和5%流動相B洗脫2 min，然后至13 min流動相B由5%至25%，然后至18 min流動相B由25%至50%，保持洗脫6 min。

采用Waters TQ-S質譜儀在負離子模式下進行質譜分析。ESI源條件如下：離子源溫度325℃，離子源電壓（ISVF）：4 000 V；采用MRM模式檢測待測離子對。

采用skyline軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 色譜質譜分離方法

本實驗使用Waters TQ-S電噴霧質譜儀通過梯度洗脫的方法分離HMOs，色譜分離圖見圖1，圖2。從圖中可以看出，應用該方法可以成功檢測HMOs，6種HMOs標準品出峰保留時間在10～20 min之間，出峰順序依次為3'-FL、2'-FL、6'-SL、LNnT、3'-SL、LNFP-I。經前處理的母乳樣品應用該方法進行分離檢測時，6種HMOs均能有效分離。表明實驗中梯度洗脫條件符合HMOs檢測，可進一步進行后續實驗。

圖1 6種母乳低聚糖標準品色譜圖

圖2 母乳低聚糖樣品色譜圖

6種HMOs標準曲線、R2、回收率及RSD見表1，從表中可見：6種HMOs標準曲線線性關系良好，R2均高于0.99，RSD值均小于10%，每種低聚糖回收率均測定符合80%～120%的標準，表明該實驗方法可以對6種目標HMOs進行快速、全面的定性及定量分析。

表1 母乳低聚糖標準曲線方程及回收率

2.2 母親泌乳期內HMOs含量變化

本實驗采用Waters TQ-S電噴霧質譜儀對不同泌乳期的母乳低聚糖進行檢測，我們將不同泌乳期的母乳分為初乳、過渡乳及成熟乳。其中，初乳是生產后第1到第12天的母乳，過渡乳是生產后第13天至第30天的母乳，成熟乳是生產后第2個月以后的母乳。從表2中我們可以看到，在收集的所有不同泌乳期母乳樣品中，檢測到6種HMOs的組成和含量均在不斷變化。其中2'-FL、6'-SL、LNnT、LNFP-I的含量隨著泌乳期的延長而逐漸降低。6種HMOs中，只有3'-FL的含量隨著泌乳期的延長而逐漸升高，而3'-SL的含量隨著泌乳期的延長含量先降低后升高。從表2中可以看到，HMOs在不同的泌乳期含量不同，泌乳初期相對含量更多，隨著泌乳時間的延長，大部分HMOs在母乳中的含量逐漸降低。

表2 不同泌乳階段母乳低聚糖含量變化

2.3 不同分泌型母親泌乳期內HMOs變化

2-巖藻糖基乳糖（2'-FL）和3-巖藻糖基乳糖（3'-FL）是重要的母乳低聚糖類，而2'-FL已添加到嬰幼兒配方奶粉中以縮小母乳替代品與母乳間功能性的差距。母親攜帶巖藻糖基轉移酶2(FUT2)基因類型可影響母乳中HMO成分，這直接影響了嬰兒腸道菌群的定植時間和發展。基因的突變可導致其編碼的FUT2失活，將FUT2基因處于活化狀態的人群歸類為分泌型，失活狀態的人群為非分泌型，而不同分泌型母親在哺乳期所分泌母乳中乳糖巖藻糖基化的過程會發生變化[11]。在本研究中我們發現，隨著泌乳期的延長，2'-FL的含量隨著泌乳期的延長在逐漸降低，而3'-FL的含量則逐漸升高。有研究應用2'-FL/3’-FL的相對含量比例進行泌乳母親分型，2'-FL/3'-FL的相對含量比例大于6.5為分泌型母親，而2'-FL/3'-FL的相對含量比例低于6.5則為非分泌型母親[12]。從表3中我們可以看到，我們所收集的母乳低聚糖的母親多為分泌型母親，分泌型與非分泌型母親的比例為42∶21，分泌型母親占比為66.7%，分泌型母乳中HMO的組成成分不同于非分泌型，特別是2'-FL和3'-FL的含量區別較大。在分泌型母親的母乳中，2'-FL的含量要高于非分泌型母親母乳的含量，而在非分泌型母親的母乳中，3'-FL的含量要略高于分泌型母親母乳的含量。

表3 不同分泌型母親母乳中低聚糖含量

3 結 論

3.1 生產方式對母乳低聚糖含量的影響

通過檢測分析產婦泌乳后母乳低聚糖含量及組分變化情況發現，通過自然生產的產婦母乳中低聚糖的含量與剖腹產產婦母乳中低聚糖的含量有一定的差異。其中，通過自然生產的產婦母乳中2'-FL、LNFP-I的含量均略高于剖腹產產婦母乳中的含量。而剖腹產產婦母乳中LNnT的含量則略高于自然生產的產婦母乳中的含量。這表明，生產方式可能對產婦母乳中低聚糖的含量有一定的影響[13]。

3.2 個體差異對母乳低聚糖含量的影響

通過采集的63位母親的母乳樣品中6種HMOs的統計分析結果我們發現，個體差異對母乳中低聚糖的含量有一定的影響。其中，2'-FL的濃度在母親母乳中的變動范圍較大，在泌乳初期達到最高值，然后隨著泌乳時間的延長含量逐漸減少。而3'-FL是所有6種HMOs成分中唯一一種含量隨著泌乳時間延長而基本保持增加的低聚糖。研究發現，大部分母親的母乳樣品中均含有這6種HM Os，但部分母親的母乳樣品中未檢測到2'-FL及LNFP-I，這表明母體差異對母乳低聚糖的含量及組分有一定影響[14-15]。

已有研究發現，HMOs具有調節免疫，幫助大腦發育及調節嬰兒腸道菌群等功能，有助于嬰幼兒早期成長發育[16-17]。上個世紀九十年代，許多乳品企業將一些雙歧桿菌活性低聚糖作為母乳低聚糖的替代物添加到嬰兒配方奶粉中。目前，許多國外生產嬰兒配方粉的乳品企業已經在生物合成母乳低聚糖方面取得了重大成功。目前，經歐盟和美國批準并且能夠商業化的母乳低聚糖一般是2'-FL、LNnT兩種。在我國，針對中國母乳HMOs的研究還處于初級階段，特別是在母乳低聚糖的合成方面研究較少。因此，應加大對中國國內不同地區、不同種族、不同生活習慣、不同生產方式、不同年齡的產婦母乳收集，建立中國母親母乳中HMOs數據庫，為中國自主乳品企業生產添加母乳低聚糖的嬰兒配方粉提供理論依據。