高效液相色譜-蒸發光散射法測定母乳及牛乳中5種磷脂質量濃度

梁雪，田芳，蔡小堃，毛穎異，Nick A.Cellar，趙艷榮，朱惠蓮

（1.雅培營養中國研發中心，上海200233；2.中山大學公共衛生學院營養學系，廣州510080；3.雅培營養品，美國 哥倫布OH 43219）

0 引 言

磷脂是一類存在于生物界的含磷脂質，母乳和牛乳中磷脂主要包括磷脂酰乙醇胺（PE），磷脂酰肌醇（PI），磷脂酰絲氨酸（PS），磷脂酰膽堿（PC）和鞘磷脂（SM）5大類[1]。目前，乳制品磷脂總含量的測定主要采用稱重法[2-3]、比色法[4]、紫外分光光度[5]和紅外光譜(FTIR)法[6]等，而磷脂不同組分的分離和測定的方法有薄層層析色譜法（TLC）[7]、核磁共振波譜法（NMR）[8]和高效液相色譜法（HPLC）[9-10]和液相色譜串聯質譜法(LC-MS)[11]。HPLC-ELSD法普遍用于檢測牛奶、乳制品[12-18]和母乳[19-20]的磷脂，而檢測母乳中磷脂的研究中，只有Giuffrida等人[20]對母乳基質中的方法進行驗證，但沒有提供磷脂的檢測限（LOD）和定量限（LOQ）的數據信息，并且PI和PS的分析范圍可能需要改進，以滿足母乳中這兩種較低水平磷脂的定量測定需要。因此，建立磷脂含量的準確、高效及簡便的測定方法是目前仍需解決的問題。

本文建立并優化HPLC-ELSD法測定母乳和牛乳中5種磷脂質量濃度及構成，該方法操作簡便快速、精密度好、回收率高，對乳制品種磷脂的定量檢測提供參考依據。

1 實 驗

1.1 試劑耗材與儀器

三氯甲烷，HPLC級，國藥集團化學試劑有限公司；甲醇，Thermo Fisher；甲酸、氯化鈉，anpel；三乙胺，Sigma-Aldrich）。

高效液相色譜儀（HPLC），Agilent1260；配置蒸汽發光檢測器（ELSD）Agilent1260，Agilent；色譜柱BETA SIL silica-100（200×3 mm，3μm），Thermo Fisher；Thermo REL5004V冰箱，Thermo Fisher；Gilson移液槍，Gilson；PTFE濾膜（13 mm×0.2μm），Agilent。

1.2 標準品

PI，P0639-25M G（PI鈉鹽），≥99%；PE，P7943-25MG（來自蛋黃），≥97%；PC，P3556-100MG（來自蛋黃），≥99%；SM，85615-50MG（來自蛋黃），≥98%；PS，P7769-25MG（來自牛腦），≥97%；均來自Sigma公司。

1.3 樣品

母乳樣品：廣州地區成熟乳（n=10，產后天數40～45 d）,母乳樣品從廣州中醫藥大學祈福醫院收集（全段乳）；

牛乳樣品（液態乳）：包括膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、超高溫瞬時滅菌（UHT）全脂牛乳、超高溫瞬時滅菌（UHT）低脂牛乳購于當地市場，詳細信息見表1。

表1 牛乳生產基本信息

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的制作

（1）配制儲備液。取標準品PE，PI，PS，PC，SM（均取25.00 mg，精確到0.01 mg），加溶劑氯仿/甲醇（9∶1）混合液，用容量瓶定容（PE，PS，PC，SM 10 mL，PI50 mL），配置成儲備液。

（2）配制系列混合標準工作液。混合標準儲備液的配制：分別取0.5 mL PC儲備液，0.5 mL PS儲備液，0.5 mL PE儲備液，0.5 mL PS儲備液，1.5 mL PI儲備液于玻璃管中，用移液管移取，充分混勻。

表2 系列混合標準工作液的配制

（3）繪制標準曲線。將磷脂混合標準系列測定液依次進行HPLC色譜測定。記錄各組分的色譜峰面積，以峰面積為縱坐標，以標準測定液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.4.2 乳樣中磷脂的測定

參考Lopez等人[13]的方法，取250μL乳樣（母乳/牛乳，每組樣品都檢測相同的一個平行樣，檢測結果取平均值，以保證結果的穩定性及準確性），加入250μL的水和9.5 mL氯仿-甲醇混合液（2∶1，體積比），放入50 mL玻璃管中，渦旋充分混勻。樣本溶液放入超聲波振蕩器中40℃超聲15 min，取出樣本溶液并加入2 m L的飽和氯化鈉溶液，渦旋混合30 s以上，充分混勻。離心（2 000 r/min，5 min），出現分層（上層為水相，下層為有機相），用玻璃滴管將下層有機相轉移到玻璃頂空瓶中。玻璃管剩余溶液加氯仿-甲醇混合液（6∶1，體積比）7 m L再次提取，渦旋30 s以上，充分混勻。再次離心(2 000 r/min，5 min)，吸取下層有機相溶液合并于頂空瓶中。在40℃水浴中氮吹將溶劑蒸發至干，樣品溶于250μL氯仿-甲醇混合液（9∶1，體積比），渦旋充分混勻，通過0.2μm×4 mm PTFE濾膜過濾，轉移到進樣小瓶，進行HPLC-ELSD分析。色譜柱為BETA SIL silica-100（200 mm×3 mm，3μm），柱溫為40℃，進樣量為25μL，ELSD檢測器蒸發溫度為85℃，噴霧溫度為40℃,流速N2為1.4 L/min，流動相A為三氯甲烷-甲醇-甲酸（濃度1 mol/L，三乙胺調p H=3）（87.5∶12∶0.5，體積比），流動相B為三氯甲烷-甲醇-甲酸（濃度1 mol/L，三乙胺調p H=3）（28∶60∶12，體積比）。HPLC參考色譜梯度洗脫程序見表3。

表3 HPLC參考色譜梯度洗脫程序

1.5 統計學分析

采用SPSS 22.0進行數據處理與分析。采用單因素ANOVA的多重比較來評估多個樣本間數據差異的顯著性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 方法驗證

本研究選用廣州地區收集的3例成熟母乳（40～45 d）樣品充分混勻，做為方法驗證的基質樣品，對所建立的磷脂分析方法的檢出限（LOD）、定量限（LOQ）、分析范圍、精密度及準確性進行了全面的驗證。

2.1.1 標準曲線分析范圍，檢出限與定量限

使用標準系列混合工作液建立校準曲線，根據母乳樣品中各磷脂的質量濃度水平確定合適的分析范圍。5種磷脂在驗證的質量濃度范圍內呈良好的線性關系，相關系數均大于0.999，分析范圍以mg/L母乳樣品表示。待測樣品的色譜峰信噪比為3時對應的濃度為本方法磷脂的檢出限（LOD），以信噪比為10時對應的濃度為本方法磷脂的定量限（LOQ），經過計算得出，本方法的檢出限（LOD）范圍為0.69～2.97 mg/L，定量限（LOQ）范圍為2.29～9.90 mg/L，在此范圍內，分析方法具有良好的靈敏度，可以滿足母乳樣品中5種磷脂的定量檢測，見表4。

表4 磷脂的分析范圍及相關系數 g/L

2.1.2 精密度與準確性

選用廣州地區成熟乳制備混樣（n=3，產后天數40～45 d）（乳樣品是當天收集分裝，保存在-80°C冰箱。混合樣品是將樣品解凍充分混勻，分裝保存在-20°C冰箱），計算此混樣中各磷脂8天16次測定結果的平均值及標準偏差，5種磷脂檢測結果的RSD的范圍在2.73%～10.03%之間，說明此方法具有良好的精密度。以此樣品做為基質，選用3個不同的磷脂質量濃度水平（分別為基質本底質量濃度的50%、100%和150%）進行加標回收試驗，研究每個濃度水平3天6次檢測結果的平均回收率，以驗證此方法的準確性。5種磷脂在3種濃度水平的加標回收率均在80.17%～101.81%之間，總磷脂含量的回收率在90.06%～91.37%之間，說明此方法具有良好的準確性，能夠滿足磷脂分析的要求，驗證結果見表5。

表5 磷脂測定方法精密度和加標回收率的驗證結果

2.2 母乳和牛乳的測定與分析

采用上述方法對廣州地區收集的10個成熟乳樣品（40～45 d），以及5種市面上常見的牛乳樣品（膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、巴氏殺菌脫脂牛乳、UHT全脂牛乳、UHT低脂牛乳）的磷脂質量濃度進行測定，見表6。對母乳和牛乳磷脂質量濃度進行單因素ANOVA分析，再采用LSD進行兩兩比較。

母乳樣品的總磷脂質量濃度顯著高于3種不同生產工藝的全脂牛乳（膜過濾牛乳、巴氏殺菌全脂牛乳、UHT全脂牛乳）（P＜0.05），表現為母乳SM的質量濃度約是3種全脂牛乳SM的2.1倍；3種全脂乳之間總磷脂質量濃度無顯著差異（P＞0.05）；對于同一生產工藝的牛乳來說，全脂牛乳總磷脂的質量濃度大于脫（低）脂牛乳（P＜0.05），表現為全脂牛乳PE、PC和PI的質量濃度約是脫脂牛乳的1.6倍；不同工藝生產的脫（低）脂乳無差異（P＞0.05）。

對于母乳和牛乳磷脂的構成比，采用卡方檢驗進行分析，母乳磷脂與3種全脂牛乳之間、不同生產工藝的全脂乳之間、同一生產工藝的脫（低）脂牛乳和全脂牛乳脂檢均無差異（P＞0.05），因此母乳和牛乳磷脂的構成比無統計學差異。經過多重比較，母乳與牛乳中PE和SM的百分含量差異顯著，成熟乳中的PE的構成比比牛乳低大約10%，而SM的構成比比牛乳高大約10%。結果表明，母乳磷脂與牛乳磷脂組成相似，其中以PE、PC和SM為主(約占磷脂總量的80%)。而3種優勢類型的磷脂在母乳中的比值為PE∶PC∶SM=1.2∶0.8∶1.0，牛乳中的比值為PE∶PC∶SM=2.6∶1.6∶1.0。結果如表7所示。

表7 不同地區母乳磷脂的質量濃度及構成比

圖1 母乳和牛乳中磷脂構成比的比較

3 討 論

本研究顯示，PE、PI、PS、PC和SM的分析范圍分別為11.9～142.9，9.5～57.2，11.5～69.1，14.2～113.6 mg/L和13.6～109.0 mg/L，定量限分別為4.1，9.9，6.3，4.3 mg/L和2.3 mg/L。這表明建立的方法靈敏度較高，可以對母乳和全脂牛乳中的5類磷脂進行定量分析，見表6。將樣品量增加到0.5 mL來檢測脫脂牛乳中的磷脂，以確保其檢測結果在方法分析范圍內。該方法步驟相對較少，簡化了樣品制備過程，適用于大樣本量的常規分析。

表6 母乳和牛乳中磷脂質量濃度 mg/L

分析方法、地理差異、樣品采集季節、哺乳期、胎齡、飲食等因素均可導致磷脂質量濃度和組成的差異。用建立的HPLC-ELSD法測定母乳中總磷脂的平均質量濃度為204.5±9.4 mg/L(n=10)，本研究結果位于世界各地報道的結果范圍內，且與新加坡早期成熟乳的研究結果比較接近（具體數據見表7）。關于母乳的構成，本研究結果顯示，成熟乳中磷脂的構成以PE為主，其次是SM和PC，與日本早期成熟乳的研究結果相似，而在新加坡、德國和西班牙等地的研究中發現，SM在早期成熟乳的構成中起主要作用。

本研究結果表明，不同的生產工藝，包括UHT、巴氏殺菌和膜過濾，對牛乳中磷脂的質量濃度和構成沒有顯著影響。膜過濾是一個相對溫和的處理過程，而巴氏殺菌和UHT則要經過一定的熱處理。本研究結果表明，在牛乳熱處理過程中，磷脂是一類相對穩定的活性物質，磷脂是乳脂球膜(M FGM)的重要組成部分，同時具有親油性和親水性，有一定的乳化作用。有研究報道存在于乳化液中的磷脂對整個乳化體系的熱穩定性有提升作用[22]，而分離出來的MFGM（富含磷脂）在空氣中儲存期間會經歷嚴重的氧化反應[23]。所以，磷脂的穩定性會受到多方面因素的影響，與其存在的基質和氧化條件密切相關。脫脂牛乳是通過去除全脂牛乳中的乳脂來生產的，Deeth等人[24]報道，脫脂奶中也含有膜成分，其含量和組成均與MFGM相似。本研究結果也表明，脫脂后的牛乳中仍有約60%的磷脂殘留在乳液中，且磷脂組成與全脂牛乳相似。這些都使牛乳及其加工制品（乳脂肪、乳粉等）成為嬰兒配方奶粉中磷脂的良好來源，為其提供與母乳相似的營養價值。

4 結 論

本研究建立的HPLC-ELSD方法具有良好的準確性和精密度，方法的分析范圍、檢出限和定量限均能滿足母乳和牛乳中磷脂的檢測要求。建立的方法適用于母乳和牛乳中5種磷脂(PE、PI、PS、PC、SM)的測定。該方法的應用表明，該方法是常規分析中快速、準確地鑒定和定量5類磷脂的可靠的方法。全脂牛乳的總磷脂質量濃度略低于早期成熟母乳(40～45 d)，而牛乳的磷脂構成與母乳相似。這表明牛乳是一種很好的磷脂來源，可以為嬰兒配方奶粉提供這些重要的活性營養素，其質量濃度和構成與母乳相似。