乳源性骨橋蛋白安全性及生理功能研究進(jìn)展

李娜，荀一萍，王永霞，朱宏，王世杰

（1.河北工程大學(xué)，河北 邯鄲075000；2.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司 石家莊050221）

0 引 言

骨橋蛋白（Osteopontin,OPN）最早發(fā)現(xiàn)于成骨細(xì)胞中，后被認(rèn)為是哺乳動(dòng)物乳汁中一類重要的生物活性蛋白[1-2]。人乳中的OPN質(zhì)量濃度最高，在不同國(guó)家地域間存在顯著性差異，并隨著泌乳期延長(zhǎng)呈下跌趨勢(shì)，中國(guó)人母乳中OPN的中位質(zhì)量濃度為266.2 mg/L，占人乳總蛋白的2.7%[3]。牛乳和以牛乳為原料生產(chǎn)的嬰幼兒配方粉中OPN質(zhì)量濃度則顯著低于人乳，分別為18 mg/L和9 mg/L[4]。臍帶血和三月齡嬰兒血漿中的OPN水平比正常成年人高7～10倍，指示其參與了嬰幼兒身體發(fā)育及免疫等多種生理過程[5-7]。為了優(yōu)化嬰幼兒奶粉的配方設(shè)計(jì)和評(píng)價(jià)乳OPN對(duì)早期生命的作用，國(guó)外已進(jìn)行了許多研究。目前，從牛乳中分離純化的OPN已上市，毒理學(xué)試驗(yàn)、動(dòng)物模型和嬰兒臨床試驗(yàn)也驗(yàn)證了商業(yè)化牛乳OPN的安全性及其重要的生物學(xué)功能。

1 乳源性O(shè)PN生物學(xué)特征

人OPN由單拷貝基因編碼，在轉(zhuǎn)錄過程中，可以進(jìn)行選擇性剪接[8]；同時(shí)，OPN還可通過磷酸化、糖基化以及蛋白酶切割作用進(jìn)行翻譯后修飾，因此OPN具有許多亞型[9-10]，分子質(zhì)量在25～75 ku之間不等[11]。從共性上來看，乳源性O(shè)PN是一種高度磷酸化和糖基化的親水性酸性蛋白，其上存在一個(gè)保守的調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附RGD序列、一個(gè)SVVYGLR基序（牛：SVAYGLK）和多種蛋白酶的切割位點(diǎn)，見圖1。這些結(jié)構(gòu)為其生理功能調(diào)控提供了基礎(chǔ)。

1.1 人及牛乳源性O(shè)PN的結(jié)構(gòu)

人及牛乳源性O(shè)PN在結(jié)構(gòu)上極為相似，見圖1，人乳OPN含有298個(gè)氨基酸，牛型僅包含262個(gè)殘基，二者61%的氨基酸一致，另外14.7%的氨基酸殘基具有高度的結(jié)構(gòu)相似性。目前人們對(duì)牛和人乳源性O(shè)PN的翻譯后修飾已具有較為透徹的研究，首先，在磷酸化方面，人乳OPN中有36個(gè)磷酸化位點(diǎn)（34個(gè)磷酸絲氨酸、2個(gè)磷酸蘇氨酸），牛乳OPN中約有28個(gè)磷酸化位點(diǎn)（27個(gè)磷酸絲氨酸、1個(gè)磷酸蘇氨酸），磷酸化排列成3-5個(gè)磷酸簇，主要位于激酶FAM 20C的靶序列中[12]；在糖基化方面，牛乳OPN中靠近RGD基序的區(qū)域含有三個(gè)O-糖基化蘇氨酸殘基，人乳OPN除了含有以上3個(gè)糖基化位點(diǎn)外，還包含另外兩個(gè)蘇氨酸連接的寡糖，糖基化的作用目前并不明確，但它們靠近整合素結(jié)合基序的位置可能暗示了碳水化合物對(duì)內(nèi)源性乳蛋白酶裂解的保護(hù)作用；最后，各種蛋白酶的水解作用也是乳源性O(shè)PN翻譯后修飾的重要形式，通過蛋白酶切割，可對(duì)OPN的細(xì)胞黏附和遷移能力進(jìn)行功能調(diào)控[13-15]。

圖1 牛乳和人乳OPN結(jié)構(gòu)比較[14-15]

圖1中，磷酸化和糖基化位點(diǎn)分別以黑色和灰色背景突出顯示。RGD序列加粗顯示，SVVYGLR基序加下劃線，引入的間隙用“.”表示。人乳OPN中組織蛋白酶D和基質(zhì)金屬蛋白酶的切割位點(diǎn)分別用黑色和灰色箭頭在序列下標(biāo)出，凝血酶和纖溶酶的切割位點(diǎn)分別用三角和菱形表示。

1.2 乳源性O(shè)PN與癌源性O(shè)PN的關(guān)系

乳源性O(shè)PN與癌源性O(shè)PN是同一個(gè)基因編碼的不同的蛋白質(zhì)。目前國(guó)內(nèi)圍繞OPN的研究大多集中在OPN的異常表達(dá)及其與癌癥等疾病的臨床病理學(xué)研究中。在臨床領(lǐng)域，由于癌癥患者血漿中OPN的水平顯著升高，因此將這種異常表達(dá)的OPN作為某些癌癥的診斷標(biāo)志物和預(yù)后因子[16]，目前尚不清楚這種異常表達(dá)是疾病發(fā)展過程的一部分還是機(jī)體應(yīng)對(duì)癌癥的免疫反應(yīng)[13]。可以肯定的是，腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)的OPN與正常細(xì)胞表達(dá)的OPN具有不同的結(jié)構(gòu)和功能[17]。首先，癌源性的OPN為缺少一個(gè)外顯子的OPN剪接變體，而在牛及人乳OPN中，未發(fā)現(xiàn)任何形式的選擇性剪接[18-19]。其次，大多數(shù)的腫瘤轉(zhuǎn)化細(xì)胞表達(dá)低磷酸化形式的OPN[16]，而牛及人乳源性O(shè)PN均被高度磷酸化。目前無(wú)任何證據(jù)表明乳源性O(shè)PN參與了癌癥的發(fā)展。并且在最近的一項(xiàng)研究中，荷瘤小鼠飲用添加質(zhì)量濃度為300 mg/L牛乳OPN的水可以顯著降低皮下腫瘤的生長(zhǎng)速度和腫瘤大小[20]。以上事實(shí)表明，乳源性O(shè)PN與人體癌癥并無(wú)直接關(guān)系。

2 乳源性O(shè)PN的安全性

目前，商業(yè)化乳源性O(shè)PN可通過分離純化技術(shù)從牛乳中分離得到，且已通過了較全面安全性評(píng)價(jià)，未來有可能成為新的食品原料。如LacProdan?OPN-10，是一種采用陰離子交換技術(shù)從牛乳清中制備得到的乳清蛋白粉，總蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)約78%，其中OPN占比高達(dá)95%[21]。在毒理安全性評(píng)價(jià)中，該產(chǎn)品在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中均不具有遺傳毒性，攝入高劑量的該產(chǎn)品也未發(fā)現(xiàn)亞慢性毒性和致畸性，見表1。基于上述良好的試驗(yàn)安全性，商業(yè)化牛乳OPN已進(jìn)入嬰兒人群的臨床實(shí)驗(yàn)階段中，并取得了積極的成果[22]。市場(chǎng)調(diào)研結(jié)果顯示，澳洲“Sunwild farm”旗下的一款嬰兒營(yíng)養(yǎng)粉中已率先添加了牛乳OPN，這預(yù)示著在不久的將來，OPN可能引領(lǐng)新的市場(chǎng)趨勢(shì)。

表1 關(guān)于LacProdan?OPN-10的安全性評(píng)價(jià)及部分喂養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

3 乳源性O(shè)PN的生理功能

3.1 增強(qiáng)免疫功能

母乳是0～6月齡嬰兒最好的食物，母乳喂養(yǎng)可以幫助嬰幼兒建立良好的免疫系統(tǒng)，這是普通嬰幼兒配方奶粉無(wú)法替代的[24]，在240個(gè)母乳細(xì)胞因子相關(guān)基因中，OPN基因表達(dá)量最高，這暗示了OPN在嬰兒免疫發(fā)育中的潛在作用[25]。嬰幼兒配方奶粉中OPN的含量極低，為了評(píng)估在配方奶粉中添加牛乳OPN的效果，上海復(fù)旦大學(xué)招募了320名新生兒進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)臨床實(shí)驗(yàn)，受試嬰兒分別質(zhì)量濃度以65 mg/L或130 mg/L（分別為人乳OPN水平的50%和100%）的劑量喂食同一種普通配方奶粉，并與母乳喂養(yǎng)組嬰兒進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，在嬰兒配方奶粉中添加OPN可改變嬰兒免疫細(xì)胞的組成，其中T細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例有所增加[26]，同時(shí)嬰兒血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α顯著降低，嬰兒發(fā)熱率以及發(fā)熱天數(shù)明顯減少，氨基酸代謝和細(xì)胞因子反應(yīng)也更接近母乳喂養(yǎng)的嬰兒[22]，這些結(jié)論說明了牛乳OPN在一定程度上可以等效替代人乳OPN發(fā)揮免疫促進(jìn)的功能。仔豬的早產(chǎn)模型中發(fā)現(xiàn)，在奶粉中添加乳OPN可以減輕小豬發(fā)生壞死性小腸結(jié)腸炎的程度[27]，提示OPN提高免疫的能力同樣適用于早產(chǎn)兒。

乳OPN增強(qiáng)免疫的機(jī)制被認(rèn)為是多種免疫作用的結(jié)果。首先，OPN是誘導(dǎo)Th1型免疫的關(guān)鍵細(xì)胞因子，乳OPN可能通過誘導(dǎo)Th1型免疫來增強(qiáng)嬰幼兒抵抗力，Th1免疫有助于清除細(xì)胞內(nèi)病原體，證據(jù)表明，OPN敲除小鼠表現(xiàn)出缺陷的Th1免疫反應(yīng)，比野生型小鼠更容易受到病毒和多種病原菌的感染[28-29]。其次，OPN還可直接與細(xì)菌結(jié)合，并通過整合素介導(dǎo)單核細(xì)胞對(duì)OPN包被菌進(jìn)行吞噬。此外，人們發(fā)現(xiàn)乳OPN可與乳鐵蛋白形成強(qiáng)靜電復(fù)合物，每個(gè)OPN分子都能與3個(gè)乳鐵蛋白分子結(jié)合，因此，OPN可能通過保護(hù)乳鐵蛋白免受蛋白水解，并協(xié)同乳鐵蛋白發(fā)揮免疫作用[30-31]。

3.2 促進(jìn)大腦發(fā)育

嬰兒期是人類大腦發(fā)育的關(guān)鍵時(shí)期，在這個(gè)階段，大腦生長(zhǎng)迅速，對(duì)營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境因素十分敏感。與奶粉喂養(yǎng)的嬰兒相比，母乳喂養(yǎng)嬰兒的認(rèn)知能力顯著提升，OPN就是造成這種差異的原因之一。

乳中的OPN被攝入后，可部分抵抗新生兒胃液的消化，并通過循環(huán)系統(tǒng)被吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)至不同的組織器官中發(fā)揮作用。同位素示蹤技術(shù)證明了經(jīng)口攝入的乳OPN可進(jìn)入至小鼠大腦，乳OPN通過上調(diào)大腦中內(nèi)源性O(shè)PN的表達(dá)來促進(jìn)大腦中NG-2膠質(zhì)細(xì)胞的增殖分化以及中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的形成，這對(duì)大腦的感覺、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知發(fā)育具有有利的作用，與OPN基因敲除母鼠喂養(yǎng)的小鼠相比，野生型母鼠喂養(yǎng)的小鼠在被動(dòng)回避和轉(zhuǎn)桿試驗(yàn)等行為學(xué)測(cè)試中均顯示出更高的記憶和學(xué)習(xí)能力[5]。此外，OPN還具有神經(jīng)保護(hù)的功能，當(dāng)大腦受到損傷或刺激時(shí)，OPN有助于腦組織中星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化和腦損傷的愈合[32]，Chen認(rèn)為，OPN可通過抑制caspase-3裂解和抗凋亡細(xì)胞死亡的途徑，改善缺氧缺血性腦損傷新生兒的遠(yuǎn)期神經(jīng)功能[33]。

3.3 刺激腸道發(fā)育

在出生后的前幾個(gè)月內(nèi)，嬰兒的腸道經(jīng)歷了快速生長(zhǎng)和分化，乳源性O(shè)PN可以改變此時(shí)期腸道基因的表達(dá)譜，改善腸道增殖和腸道免疫。體外研究表明，牛及人乳OPN可以通過觸發(fā)幾種不同的信號(hào)通路正向調(diào)節(jié)與腸道增殖相關(guān)的基因表達(dá)，顯著促進(jìn)人腸上皮細(xì)胞的增殖[34]。為了評(píng)估乳源性O(shè)PN對(duì)靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型腸道基因表達(dá)的影響，Donovan分別使用母乳、普通嬰幼兒配方奶粉和添加了質(zhì)量濃度為125 mg/L牛乳OPN的配方粉喂養(yǎng)新生的恒河猴3個(gè)月，對(duì)其空腸mRNA進(jìn)行微陣列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通奶粉喂養(yǎng)組與母乳喂養(yǎng)組之間有1017個(gè)基因存在表達(dá)差異，而OPN奶粉喂養(yǎng)組與母乳喂養(yǎng)組之間僅有271個(gè)基因差異表達(dá)，這表明在配方奶粉中添加牛OPN顯著改變了腸道基因表達(dá)譜，使其更接近母乳喂養(yǎng)的新生兒[23]。但乳OPN在人類嬰兒中是否存在類似的作用還需要進(jìn)一步研究。

3.4 其他功能

乳源性O(shè)PN除了對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育具有有益的影響外，在其它領(lǐng)域也具有廣泛的作用。在預(yù)防齲齒方面，體外模型表明乳源性O(shè)PN通過改變口腔細(xì)菌的表面疏水性來阻止菌體黏附，并顯著抑制牙齒生物膜的形成和降低該生物膜的穩(wěn)定性[35-36]。在輔助生殖技術(shù)方面，使用牛乳源性O(shè)PN處理精子或成熟卵母細(xì)胞可以改善牛的體外受精、卵裂和胚胎發(fā)育[37]，這對(duì)于畜牧生產(chǎn)[38]甚至人類的輔助生殖技術(shù)具有借鑒作用。此外，大量研究表明，酒精喂養(yǎng)小鼠通過口服牛乳OPN可加強(qiáng)胃腸道保護(hù)功能和抗炎、抗脂肪變性的作用，進(jìn)而有效預(yù)防酒精性肝病的發(fā)生，因此，乳源性O(shè)PN可作為預(yù)防和治療酒精性肝損傷的一種簡(jiǎn)單有效的營(yíng)養(yǎng)治療策略[39-40]。

4 結(jié)束語(yǔ)

由于具有較高的安全性和對(duì)嬰幼兒不可或缺的生理功能，乳源性O(shè)PN在乳品工業(yè)中有著巨大的應(yīng)用前景。特別是針對(duì)嬰幼兒配方食品，牛乳OPN與母乳OPN在結(jié)構(gòu)和功能上相似，在嬰幼兒配方食品中額外強(qiáng)化一定濃度的牛乳OPN可以使奶粉的成分更接近母乳，以減少奶粉喂養(yǎng)與母乳喂養(yǎng)的差異。另外，在功能性食品領(lǐng)域，乳OPN在提高免疫力，預(yù)防齲齒和酒精性肝損傷等方面也有一定的成人應(yīng)用潛力。但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于乳OPN的研究處于起步階段，在提取技術(shù)、功能性研究以及作用機(jī)理方面存在嚴(yán)重不足。因此有必要對(duì)乳OPN進(jìn)行更嚴(yán)謹(jǐn)和深入的功能性和安全性評(píng)價(jià)，如劑量-效應(yīng)關(guān)系等研究。