大黃素對(duì)白內(nèi)障大鼠晶狀體氧化應(yīng)激和炎癥影響的機(jī)制研究

趙勇潔 尚利曉 李 琰

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，其特點(diǎn)是胰島素分泌減少或作用缺陷導(dǎo)致的高血糖。長(zhǎng)期高血糖與許多胰島素依賴(lài)性器官如視網(wǎng)膜、晶狀體、神經(jīng)元和腎臟的并發(fā)癥相關(guān)[1]。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)預(yù)計(jì)，到2030年，全世界將有4.39億人患有糖尿病。而糖尿病患者同時(shí)患有白內(nèi)障的概率是正常人的2.5倍，且年齡越小，患白內(nèi)障的概率就越大[2]。白內(nèi)障是糖尿病患者暴露在不受控制的慢性高血糖狀態(tài)下最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，它的特征是眼晶狀體渾濁，進(jìn)一步可能導(dǎo)致失明[3]。由于糖尿病在許多國(guó)家的高發(fā)生率，糖尿病性白內(nèi)障成為了失明的一個(gè)主要問(wèn)題。

大黃素是一種天然蒽醌衍生物，是一種從植物中分離出來(lái)的中草藥的活性成分。研究發(fā)現(xiàn)大黃素具有廣泛的藥理特性，包括抗癌、保護(hù)肝臟、抗炎、抗氧化和抗菌活性[4，5]。此外，大黃素還被認(rèn)為可以通過(guò)靶向胰島素抵抗來(lái)改善葡萄糖代謝，用于治療糖尿病[6]。同時(shí)對(duì)于糖尿病的許多并發(fā)癥也有改善作用，包括糖尿病性心肌病和糖尿病腎病等[7，8]。然而，其對(duì)糖尿病性白內(nèi)障的影響尚不清楚。

本研究旨在對(duì)大黃素對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠的治療效果和對(duì)晶狀體的氧化應(yīng)激和炎癥水平進(jìn)行探討，進(jìn)一步研究其可能的分子機(jī)制，為臨床治療糖尿病性白內(nèi)障提供理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

材料與方法

1.材料：50只成年雄性Sprague-Dawley大鼠體質(zhì)量約150～220g，動(dòng)物被飼養(yǎng)在溫度(22～25℃)和濕度(25%～35%)恒定的環(huán)境中，12h明暗交替光照周期，可獲得足夠的純凈水和標(biāo)準(zhǔn)鼠糧，該動(dòng)物護(hù)理方案得到了筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)的批準(zhǔn)。STZ購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，使用前溶于20mmol/L檸檬酸鈉緩沖液中，pH 4.5(10mg STZ/ml檸檬酸緩沖液)，溶液通過(guò)0.22μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，放入已滅菌的容器中，置于冰上，溶解后10min內(nèi)使用。大黃素和水合氯醛溶液均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。SOD、MDA、IL-1β和TNF-α的ELISA試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，Keap1、Nrf2和Actin抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

2.糖尿病性白內(nèi)障大鼠模型的建立及藥物干預(yù)：將50只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、大黃素低、中、高劑量組(n=10)。禁食過(guò)夜，后4組大鼠繞開(kāi)腸道腹腔一次性注射STZ(65mg/kg)建立糖尿病大鼠模型，對(duì)照組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。48h后，從尾靜脈采血，使用Accu Chek Performa血糖儀測(cè)定血糖水平。血糖值>16.7mol/L者為造模成功。造模成功后，立即給予大黃素低(30mg/kg)、中(60mg/kg)、高(90mg/kg)劑量組大鼠大黃素灌胃，對(duì)照組與模型組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，每天1次，連續(xù)給藥8周。

3.評(píng)估大鼠體質(zhì)量和血糖：在大黃素灌胃治療的8周內(nèi)，每周進(jìn)行各組大鼠的體質(zhì)量和血糖評(píng)估，從尾血樣采血測(cè)定空腹血糖水平。治療8周后，所有大鼠均采用麻醉過(guò)量安樂(lè)死，摘除眼睛，切除和摘取完整的晶狀體，-80℃保存，直到進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4.裂隙燈檢查及白內(nèi)障分級(jí)：裂隙燈檢查每周進(jìn)行1次。使用10%水合氯醛麻醉，局部托品卡胺和鹽酸苯腎上腺素?cái)U(kuò)張瞳孔，然后用裂隙燈顯微鏡檢查眼睛。晶狀體混濁的進(jìn)展準(zhǔn)確地可分為5個(gè)階段，如之前的文獻(xiàn)所述：階段0，正常晶狀體；階段1，透鏡中心的最小不透明度；階段2，晶狀體中心和周?chē)霈F(xiàn)不透明斑片狀；階段3，晶狀體全部均勻乳光；階段4，核性白內(nèi)障伴有晶狀體混濁[9]。

5.測(cè)定大鼠晶狀體中氧化應(yīng)激與炎癥水平：每只大鼠的晶狀體均用1ml 50mmol/L的冷磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline，PBS，pH 7.4)勻漿。勻漿890g離心15min，分離上清，用于生化指標(biāo)的測(cè)定。通過(guò)測(cè)定晶狀體組織中SOD活性和MDA濃度，測(cè)定晶狀體氧化應(yīng)激。通過(guò)測(cè)定晶狀體中IL-1β和 TNF-α水平，評(píng)估晶狀體炎癥水平。對(duì)于所有氧化應(yīng)激和炎癥參數(shù)，使用了ELISA試劑盒，樣品一式3份進(jìn)行檢測(cè)，所有的評(píng)估都是重復(fù)進(jìn)行的。

6.Western blot法檢測(cè)：所有晶狀體在含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液中研磨，勻漿，然后在Eppendorf管中離心。采用透明上清液進(jìn)行蛋白測(cè)定，蛋白含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。所提蛋白質(zhì)經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電印跡在硝基纖維素膜上，并檢測(cè)Keap1和Nrf2抗體，以Actin為內(nèi)參。使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行量化，并歸一化到相應(yīng)的對(duì)照組。

結(jié) 果

1.大黃素對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠體質(zhì)量和血糖的影響：在5組大鼠中，體質(zhì)量均以雙向方式增加。在實(shí)驗(yàn)期間，與對(duì)照組比較，STZ組大鼠的體質(zhì)量增加較為緩慢，與STZ組比較，大黃素治療組大鼠的體質(zhì)量增加有所升高，直到8周齡(圖1A)。同時(shí)，與對(duì)照組比較，STZ組大鼠血糖從1～8周顯著升高，而與STZ組比較，大黃素治療組大鼠的血糖水平明顯降低(圖1B)。

圖1 大鼠體質(zhì)量和血糖變化A.體質(zhì)量變化；B.血糖水平變化

2.大黃素對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁的影響：所有患有糖尿病的大鼠都以相同的速率或多或少地患上白內(nèi)障。在注射STZ后的第4周，晶狀體才開(kāi)始變得不透明。對(duì)照組大鼠的晶狀體始終保持透明，STZ組大鼠晶狀體渾濁，已達(dá)到階段4，而經(jīng)大黃素治療8周后，大鼠晶狀體渾濁程度有所降低，抑制了糖尿病大鼠白內(nèi)障發(fā)展為階段4的速度，且高劑量的大黃素表現(xiàn)出最佳治療效果(圖2)。

3.大黃素對(duì)糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體氧化應(yīng)激和炎癥水平的影響：ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃素治療8周后，與對(duì)照組比較，STZ組大鼠晶狀體組織中SOD活性降低，MDA濃度升高；與STZ組比較，大黃素各治療組SOD活性升高(圖3A)，MDA水平顯著降低(圖3B)。同時(shí)，測(cè)定晶狀體中炎性因子IL-1β和 TNF-α水平發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，STZ組大鼠晶狀體組織中IL-1β和 TNF-α水平升高；與STZ組比較，大黃素各治療組IL-1β(圖3C)和 TNF-α(圖3D)水平降低。其中，大黃素高劑量組變化最顯著。

圖3 大鼠晶狀體中氧化應(yīng)激和炎癥水平變化A. SOD活性；B. MDA濃度；C. IL-1β水平；D.TNF-α水平；與對(duì)照組比較，*P<0.01；與STZ組比較，#P<0.05，##P<0.01，###P=0.000

4.大黃素對(duì)Keap1和Nrf2蛋白水平的影響：Western blot法檢測(cè)結(jié)果表明，大黃素治療8周后，與對(duì)照組比較，STZ組大鼠晶狀體組織中Keap1蛋白表達(dá)升高，Nrf2蛋白表達(dá)降低；而與STZ組比較，大黃素各治療組Keap1蛋白表達(dá)降低，Nrf2蛋白表達(dá)升高，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴(lài)性(圖4)。

圖4 大鼠晶狀體中Keap1和Nrf2蛋白水平變化

討 論

糖尿病是一種代謝性疾病，其特征是由于胰島素生產(chǎn)或作用的絕對(duì)或相對(duì)不足而導(dǎo)致高血糖，引起慢性高血糖、脂質(zhì)、碳水化合物紊亂、視網(wǎng)膜、腎小球和周?chē)窠?jīng)微血管病等疾病。長(zhǎng)期存在的高血糖，導(dǎo)致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經(jīng)系統(tǒng)的慢性損害和功能障礙[10]。在眼睛方面，糖尿病與白內(nèi)障或晶狀體混濁的高發(fā)生率有關(guān)[11]。到目前為止，白內(nèi)障仍然是世界上致盲的主要原因。因此，研究治療糖尿病性白內(nèi)障的藥物及其可能的作用機(jī)制顯得極其重要。

大黃素是從掌葉大黃根莖中提取的天然活性蒽醌類(lèi)化合物，是許多瀉藥和中草藥的活性成分[12]。大黃素被發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)功能，包括抗炎癥、抗癌、利尿、血管松弛、免疫抑制和抗病毒特性[13，14]。此外，大黃素還具有公認(rèn)的抗糖尿病的潛力，惡化嚙齒動(dòng)物葡萄糖耐受性，通過(guò)抑制發(fā)揮抗炎作用的NF-κB通路對(duì)糖尿病有治療作用[15，16]。而糖尿病性白內(nèi)障是糖尿病的并發(fā)癥之一，大黃素對(duì)其是否具有功能還尚不清楚。為此，筆者構(gòu)建了糖尿病大鼠模型，并通過(guò)8周大黃素低、中、高劑量的灌胃治療，發(fā)現(xiàn)大黃素可顯著降低糖尿病性白內(nèi)障大鼠體質(zhì)量和血糖的升高，可抑制糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁，ELISA結(jié)果顯示，大黃素可升高糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體中SOD活性，降低MDA濃度，還可降低晶狀體中炎性因子IL-1β和TNF-α水平。因此，大黃素可減輕糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體的氧化應(yīng)激和炎癥水平。

為了進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制，筆者檢測(cè)了各組大鼠晶狀體內(nèi)Keap1和Nrf2的表達(dá)。Keap1-Nrf2系統(tǒng)被認(rèn)為是對(duì)抗氧化應(yīng)激的主要細(xì)胞防御機(jī)制之一[17]。Nrf2是一種重要的核轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)物，作為Nrf2介導(dǎo)的抗氧化系統(tǒng)的分子開(kāi)關(guān)，它與DNA啟動(dòng)子中的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，控制許多抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄[18]。Keap1作為氧化應(yīng)激傳感器和Nrf2主要抑制劑，能與Nrf2發(fā)生蛋白相互作用，共同調(diào)控氧化應(yīng)激過(guò)程[19]。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示，大黃素下調(diào)糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體中Keap1蛋白水平，上調(diào)Nrf2蛋白水平，即激活Nrf2抗氧化通路。因此，提示大黃素可能通過(guò)抑制Keap1激活Nrf2抗氧化通路，進(jìn)而改善糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體渾濁。

綜上所述，大黃素可能通過(guò)調(diào)控keap1-Nrf2通路，提高糖尿病大鼠晶狀體抗氧化能力，減輕糖尿病性白內(nèi)障大鼠晶狀體氧化應(yīng)激和炎癥水平，以此對(duì)STZ誘導(dǎo)的糖尿病性白內(nèi)障大鼠的晶狀體渾濁具有一定的抑制作用，并且大黃素的抑制作用呈現(xiàn)一定的濃度依賴(lài)性。