孕期及哺乳期苯并[a]芘暴露與子代胰腺受損及mtDNA拷貝數的關系

夏力旦·阿力甫 魯 英 崔 蓉

多環芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一類廣泛存在于環境中的持久性有機污染物。有研究發現，PAHs暴露可能與糖尿病的發生有關[1]。環境污染物暴露導致mtDNA拷貝數的異常變化，并且與機體多種不良結局有相關性，如心血管疾病和糖尿病等[2，3]。胎兒對多環芳烴引起的DNA損傷程度可能比母親敏感10倍且可能會引發成人期的慢性疾病[4]。

本研究用PAHs的典型代表苯并[a]芘{benzo[a]pyrene，BaP}染毒，觀察不同劑量BaP染毒后，Wistar母鼠及子代血糖及mtDNA拷貝數差異性，為進一步探索孕期BaP暴露與子代糖代謝的關聯性提供依據。

材料與方法

1.試劑及儀器：純度為99.0%的苯并[a]芘(德國 Dr.Ehrenstorfer 公司)、水合氯醛(天津福晨化學試劑有限公司)、血糖儀(江蘇魚躍醫療設備股份有限公司)、ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司)、全自動石蠟包埋機及切片機(德國徠卡儀器有限公司)、組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)、分光光度計(美國賽默飛世爾科技公司)、熒光定量PCR儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

2.實驗對象：SPF(specific pathogen free)級健康未生育Wistar雌鼠24只，平均體質量為213.20±9.57g。雄鼠8只，平均體質量為211.10±8.85g。由新疆醫科大學醫學實驗動物中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(新)2018-0002。動物研究遵循了新疆醫科大學醫學實驗動物中心有關實驗動物管理和使用規定并通過了倫理審批，倫理審批號：20190226-30。

3.動物交配：適應期飼養1周，第8天晚8:00時按照雄雌1∶3比例進行合籠，次日晨用棉棒以0.9%NaCl溶液在陰道口緩慢插入雌鼠的陰道，取內容物，均勻涂抹載玻片，放置于光學顯微鏡下觀察，兩名操作者分別核查，均發現精子者判定為受孕，記為妊娠第1天。

4.動物分組及染毒：排除未受孕的大鼠，將已受孕母鼠按體質量隨機分為對照組，BaP低(2μg/kg)、中(200μg/kg)、高(800μg/kg)劑量組，每組6只孕鼠。孕鼠BaP灌胃染毒至哺乳期結束時(孕期21天，哺乳期21天，共6周)，排除體質量差異性較大子鼠，剩余子鼠隨機選其1只確定為本實驗研究對象。每組6只與母鼠相配對子鼠，共24只。以上確定的子鼠在出生第21天斷乳后(PND21)與母鼠同時、同步進行下一步實驗。BaP染毒劑量根據世界衛生組織發布的孕產婦多環芳烴接觸限量以及美國環保署等得出的呼吸道暴露BaP致癌劑量設定[5,6]。稱取一定量的BaP,溶解于玉米油中并4℃超聲30min制成一定濃度的BaP 原液，使用時按照劑量，用玉米油進行稀釋。BaP暴露從孕期開始至哺乳期結束(6周)每天灌胃1次，對照組暴露同等劑量的玉米油。染毒期間自由飲水。

表1 引物序列

結 果

1.大鼠一般情況:與對照組比較，高、中劑量組母鼠飲水量、進食量明顯減少，毛發干枯，精神狀態不佳。低劑量組母鼠與高、中劑量組比較，精神狀態較好，飲水量、進食量正常。對照組母鼠生長良好，飲水、進食及活動均正常。

2.BaP暴露與母鼠及子鼠臟器系數的變化：實驗得出，染毒組母鼠胰腺臟器系數均高于對照組，其中低劑量組母鼠胰腺臟器系數與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。隨著染毒劑量增加，高劑量組子鼠胰腺臟器系數均高于中、低劑量組及對照組(P<0.05)，詳見表2。

表2 各組大鼠臟器系數的比較

3.母鼠不同時間點空腹血糖的變化：中、高劑量組母鼠PND10及PND21空腹血糖值顯著高于GD1的空腹血糖值(P<0.05)，詳見表3。

4.母鼠斷乳期空腹血糖、胰島素、胰島素相關指數的比較：哺乳期第21天，各組母鼠空腹血糖值、胰島素含量及HOMA指數，經統計學檢驗組間比較,差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表4。

5.子鼠斷乳期空腹血糖、胰島素、胰島素相關指數的比較：子鼠胰島素水平中、高劑量組分別與對照組比較,差異有統計學意義(P< 0.05)，且對照組顯著低于高劑量組，詳見表5。

6.BaP暴露對子代胰腺組織形態的影響：子鼠胰腺HE染色結果顯示，高劑量組胰島邊界模糊，胰島內β細胞排列稀疏，細胞明顯減少，可見空泡變性及凋亡細胞，部分胰島細胞內脂質沉積。中劑量組胰島β細胞腫脹，同樣可見空泡變性。低劑量組胰島相對完整，胰島邊界較清晰，β細胞形態較好。對照組胰島邊界清晰，胰島內β細胞分布均勻，胞質豐富，胰島細胞間毛細血管豐富紅染(圖1)。

圖1 孕期BaP暴露對子鼠胰腺形態的影響(HE，×400)A.高劑量組:胰島邊界模糊，胰島內β細胞排列稀疏，如短箭頭所示可見空泡變性，三角形所示可見細胞內脂質沉積;B.中劑量組:胰島內β細胞排列稀疏，如短箭頭所示可見空泡變性;C.低劑量組：胰島相對完整，胰島邊界清晰，β細胞數目增加，細胞形態較好，無明顯的空泡變性、腫脹及脂質沉淀; D.對照組: 胰島呈橢圓形團索狀，胰島邊界清晰，β細胞分布均勻、 排列緊密，如長箭頭所示可見胰島細胞間毛細血管豐富紅染

7.母鼠及子鼠胰腺組織 mtDNA 拷貝數組間差異性分析：通過RT-PCR定量技術得出，母鼠胰腺組織平均mtDNA拷貝數組間比較，差異無統計學意義。子鼠高劑量組胰腺組織平均mtDNA拷貝數與其余3組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)。對照組胰腺組織平均mtDNA拷貝數為405.04±287.72，高劑量組平均mtDNA拷貝數為68.30±13.02,對照組是高劑量組的5.96倍，詳見圖2。

圖2 母鼠及子鼠胰腺mtDNA拷貝數與高劑量組比較，*P<0.05

討 論

研究表明，長期接觸多環芳烴與肥胖和2型糖尿病有關聯性[7,8]。BaP是毒性不良反應最強的多環芳烴之一，其接觸途徑有攝入BaP含量高的食物和呼吸道吸入[9]。高脂飲食時攝入BaP通過誘導促進2型糖尿病相關基因的表達而增加2型糖尿病的發生風險[10]。2型糖尿病的早期階段，胰腺β細胞通過胰島素的高分泌進行補償，以維持正常的血糖水平[11]。然而，由于線粒體功能紊亂，β細胞代償功能失調，進而導致β細胞凋亡[12]。本研究中，中、高劑量組母鼠均有不同程度體質量減輕現象。隨著實驗的進行，染毒組母鼠及子鼠胰腺臟器指數亦隨之升高，提示大鼠的胰腺可能發生了一定程度的損傷。

本實驗檢測了大鼠的血糖、胰島素以及HOMA指數。空腹血糖作為檢測糖尿病的“金標準”，反映胰島素分泌以及胰島β細胞功能[13]。HOMA指數已被廣泛應用于機體胰島素敏感度、胰島素抵抗水平與胰島β細胞功能的評價[14]。本研究中，中、高劑量組母鼠PND10及PND21的空腹血糖值顯著高于GD1的空腹血糖值,然而, HOMA指數組間比較，差異無統計學意義，這可能與大鼠個體差異較大或因樣本量較小有關。

研究顯示，胰島 β 細胞功能具有很強的遺傳性[15]。Simmons等[16]提出大鼠胰腺類似與人類胰腺，胎兒胰腺發育對妊娠期宮內葡萄糖水平十分敏感，故宮內不良環境可使子代胰腺發育受損，且這種效應可延續至成年。在本研究中，高劑量組子鼠胰島素水平顯著高于對照組。胰腺HE染色結果中，隨著染毒劑量的增加子代胰腺胰島邊界模糊，胰島內β細胞排列稀疏，細胞明顯減少，可見空泡變性且部分胰島細胞內脂質沉積。結合不同組間子鼠胰島素水平差異性以及胰島細胞數目及形態的改變，提示孕期BaP暴露對子代β細胞胰島功能有一定的影響。

線粒體在能量代謝、活性氧自由基生成等方面發揮著重要作用。線粒體遺傳信息只能通過母親遺傳給后代[17]。相對于核DNA,mtDNA 缺少染色質結構和組蛋白的保護并且DNA修復能力的不足，易受環境污染物影響，導致mtDNA 的突變與缺失[18]。McCarthy等[19]在非胰島素依賴性糖尿病人群中檢測出mtDNA ND1 G3316A突變。Hirai等[20]研究發現，mtDNA ND1 T3394C突變在日本糖尿病人群中高發。在大學生和親自做飯的婦女中，PAHs暴露與其mtDNA拷貝數呈負相關[21，22]。但在焦爐工人中，PAHs 暴露與mtDNA拷貝數卻呈正相關[23]。

綜上所述，本實驗以mtDNA ND1基因為切入點發現，隨著BaP暴露濃度的增加子鼠胰腺組織平均mtDNA拷貝數降低，且對照組平均mtDNA拷貝數為高劑量組的5.96倍。本研究結果為孕期BaP暴露與子代胰腺組織mtDNA拷貝數的變化之間的聯系提供了證據，其子代mtDNA拷貝數的減少可能是孕期BaP暴露導致2型糖尿病發生的重要原因之一。鑒于人類與其他哺乳動物有著許多共同的生物特性，認為表突變可能也會在人類中一代代地遺傳下去似乎是合理的。本研究也存在不足之處，因本研究染毒周期為孕期開始至斷乳期，只針對 21 天齡的子鼠進行了孕期及哺乳期BaP暴露與糖脂代謝分子機制相關研究。今后可進一步研究子代成年期糖脂代謝的情況，使研究結果更具有代表性。