褪黑素通過PPARγ-LXRα調控THP-1巨噬細胞ABCA1表達

王 雨 陳連鳳 王 偉 宋 瑋 嚴曉偉

褪黑素(melatonin)是脊椎動物的松果體合成的一種吲哚類激素，對機體膽固醇代謝具有調節作用[1]。膽固醇外流是將細胞內游離膽固醇(free cholesterol,FC)等轉運到胞外HDL顆粒的過程，是膽固醇逆轉運的第一步，也是機體調控動脈粥樣硬化(atherosclerosis)發生、發展的關鍵步驟[2]。其中，三磷酸腺苷結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)在此過程中起重要作用[3]。研究發現，褪黑素缺乏可導致大鼠巨噬細胞ABCA1介導的膽固醇外流功能降低，并導致ABCA1受體表達下降，但機制尚不明確[4]。筆者通過THP-1來源巨噬細胞體外培養，并用褪黑素溶液及相應受體拮抗劑干預巨噬細胞，探討褪黑素調控巨噬細胞ABCA1表達的作用機制。

材料與方法

1.主要試劑:褪黑素干粉購自美國Sigma 公司。THP-1細胞購自北京中國醫學科學院基礎醫學研究所細胞中心。RPMI-1640培養基購自英國Gibco-BRL公司。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、牛血清白蛋白(bovineserum albumin，BSA)購自美國Hyclone公司。佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)購自美國Sigma 公司。Trizol、總RNA 抽提試劑盒、cDNA合成試劑盒購自大連寶生物有限公司。ABCA1、LXRα和GAPDH引物購自上海生工生物工程股份有限公司。全蛋白提取試劑盒購自北京普利萊生物技術公司。兔抗人ABCA1 多克隆抗體、兔抗人LXRα多克隆抗體、兔抗人GAPDH 多克隆抗體購自英國Abcam公司。HRP 標記山羊抗兔IgG二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。PPARγ抑制劑GW9662、非選擇性MT1/MT2受體拮抗劑Luzindole、選擇性MT2受體拮抗劑K185購自美國Sigma公司。LXRα抑制劑GSK2033購自美國Glaxo Smith Kline公司。

2.THP-1細胞的培養和巨噬細胞的分化：THP-1細胞在RPMI-1640培養基和10%胎牛血清中培養，37℃、5%CO2-95%空氣的恒溫培養箱中。THP-1細胞生長至對數期時接種于6孔板，在培養液中加入終濃度為100nmol/L的PMA誘導THP-1細胞向巨噬細胞分化24h。通過倒置顯微鏡觀察細胞形態變化，流式細胞術檢測細胞表面特異性抗原CD14表達量的變化，鑒定THP-1細胞是否分化為巨噬細胞。

3.不同濃度褪黑素溶液對THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的mRNA及蛋白表達的作用:將THP-1巨噬細胞分為對照組(陰性對照組)和褪黑素干預組。其中褪黑素干預組根據濃度又分為：50nmol/L濃度褪黑素干預組(褪黑素50nmol/L組)、100nmol/L濃度褪黑素干預組(褪黑素100nmol/L組)、500nmol/L濃度褪黑素干預組(褪黑素500nmol/L組)、1μmol/L濃度褪黑素干預組(褪黑素1μmol/L組)。對照組給予不含褪黑素的RPMI-1640培養基預處理24h，而褪黑素干預組分別給予50nmol/L、100nmol/L、500nmol/L和1μmol/L的褪黑素溶液預處理24h。

實時熒光定量PCR檢測：提取各組THP-1來源巨噬細胞的總RNA，反轉錄得到cDNA。PCR引物用Primer 5.0軟件設計：ABCA1 基因上游引物: 5′-TACAGCCAGAAAGACACCAG-3′，下游引物:5′-CACAGTAGACTTTGGGAGAG-3′。LXRα基因上游引物:5′-TCAGCCGGGAGGACCAGATTG-3′，下游引物:5′-TCCGGAGGCTCACCAGTTTCATTA-3′。內參基因GAPDH上游引物:5′-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3′，下游引物:5′-ACGACCAAATCCGTTGACTC-3′。實時熒光定量PCR實驗在ABI7500 RT-PCR儀上進行，通過各孔樣品的Ct值計算樣品mRNA相對內參基因GAPDH的表達量。

蛋白免疫印跡實驗(Western blot)法分析：提取各組THP-1來源巨噬細胞胞質蛋白，BCA蛋白定量后取50μg樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離和轉膜，用含5%脫脂牛奶溶液室溫封閉60min，分別加入ABCA1、LXRα和GAPDH的一抗(稀釋比1∶500～1∶800)，4℃孵育過夜。TBST洗膜15min×3次后，加入1∶2000稀釋的相應二抗室溫孵育60min。再次用TBST洗膜15min×3次，ECL發光試劑盒顯色，X光片感光顯影，用Image J軟件分析各組ABCA1、LXRα和GAPDH的灰度值，將各組的ABCA1、LXRα分別與內參GAPDH的灰度值進行比值化處理，并比較各組ABCA1和LXRα蛋白的相對表達量。

4.褪黑素調控THP-1來源巨噬細胞ABCA1表達的信號調控機制:通過上述濃度梯度實驗獲得的結果，后續實驗均采用濃度為1μmol/L的褪黑素溶液進行。

為明確褪黑素是否通過激活LXRα來調節ABCA1的表達，筆者應用了LXRα拮抗劑GSK2033和PPARγ拮抗劑GW9662 進行后續實驗。THP -1來源巨噬細胞與10μmol/L的GSK2003(GSK組)或GW9662(GW組)溶液預孵育6h，然后與1μmol/L的褪黑素溶液干預24h。以未使用褪黑素的RPMI-1640培養基處理的細胞作為陰性對照(對照組)，以僅使用1μmol/L褪黑素處理的細胞作為陽性對照(褪黑素組)。24h后棄去干預溶液，然后收集細胞，進行蛋白質印跡(Western blot)法分析ABCA1和LXRα的蛋白表達情況。

為明確褪黑素是否通過褪黑素膜受體1型(MT1)或2型(MT2)介導的途徑調節ABCA1的表達，筆者使用了兩種拮抗劑:①非選擇性MT1/MT2拮抗劑luzindole (LUZ)；②選擇性MT2拮抗劑K185。THP-1來源巨噬細胞用10μmol/L LUZ(LUZ組)或K185(K185組)預孵育6h，然后用1μmol/L褪黑素處理24h，以未使用褪黑素的RPMI-1640培養基處理的細胞作為陰性對照(對照組)，以僅使用1μmol/L褪黑素處理的細胞作為陽性對照(褪黑素組)。24h后棄去干預溶液，然后收集細胞，進行Western blot法分析ABCA1蛋白表達情況。

結 果

1.不同濃度褪黑素溶液對THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的mRNA及蛋白表達的作用:與對照組比較，隨著褪黑素濃度的增加，巨噬細胞ABCA1 mRNA和蛋白表達均顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05，圖1A、圖2中A和C)。與對照組比較，褪黑素干預組LXRα mRNA和蛋白水平顯著升高，且呈劑量依賴性(P<0.05，圖1B及圖2中B、D)。

圖1 不同濃度褪黑素溶液干預體外培養THP-1來源巨噬細胞后ABCA1及LXRα mRNA相對表達量A.巨噬細胞ABCA1 mRNA相對表達量；B.巨噬細胞LXRα mRNA相對表達量;與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

圖2 不同濃度褪黑素溶液干預體外培養THP-1來源巨噬細胞后ABCA1及LXRα蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.LXRα蛋白Western blot法條帶圖；C.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；D.LXRα蛋白相對表達量柱形圖；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

2.GSK2033或GW9662對經褪黑素處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα蛋白表達的影響:與對照組比較，褪黑素組的ABCA1蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖3中A和C)。然而，GSK組的ABCA1蛋白表達水平顯著低于褪黑素組(P=0.000，圖3中A和C)。與上述結果類似，GW組對ABCA1表達相對褪黑素組存在顯著的抑制作用(P=0.000，圖3中A和C)。與對照組比較，褪黑素組的LXRα蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖3中B和D)。然而，與褪黑素組比較，GSK組的LXRα蛋白表達保持不變(圖3中B和D)。GW組的LXRα蛋白表達相比褪黑素組顯著下降(P=0.000，圖3中B和D)。

圖3 經褪黑素處理和GSK2033或GW9662預處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.LXRα蛋白Western blot法條帶圖；C.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；D.LXRα蛋白相對表達量柱形圖;與對照組比較，*P=0.000;與褪黑素組比較，#P=0.000

3.LUZ或K185對經褪黑素處理的THP -1來源巨噬細胞ABCA1蛋白表達的影響：與對照組比較，褪黑素組的ABCA1蛋白表達水平顯著升高(P=0.000，圖4)。然而，與褪黑素組比較，LUZ組或K185組中褪黑素上調的ABCA1蛋白表達均未被抑制(圖4)。

圖4 經褪黑素處理和LUZ或 K185預處理的THP-1來源巨噬細胞ABCA1和LXRα的蛋白表達A.ABCA1蛋白Western blot法條帶圖；B.ABCA1蛋白相對表達量柱形圖；與對照組比較，*P=0.000

討 論

ABCA1在預防動脈粥樣硬化疾病的發生中發揮重要作用[5]。Matsunaga等[6]早期研究發現，人類ABCA1表達缺陷可導致Tangier病，其特征是患者血漿高密度脂蛋白膽固醇水平大幅降低，其膽固醇外排功能受損，細胞內膽固醇酯積聚。因此，Tangier病患者往往比正常人更早發生冠狀動脈性心臟病和外周動脈粥樣硬化性疾病[7]。而上調ABCA1的表達及其膽固醇外排功能均能發揮抗動脈粥樣硬化作用[8]。為明確褪黑素對ABCA1 表達的直接影響作用，筆者用不同濃度的褪黑素體外干預THP-1 來源的巨噬細胞，發現褪黑素可同時上調ABCA1 轉錄和蛋白水平，表明一定藥理劑量濃度的褪黑素可以直接影響ABCA1 的表達水平，尤其以1μmol/L濃度的褪黑素干預組最為顯著。

研究表明，ABCA1的表達可能受到多種核轉錄因子的調控，包括肝X受體(LXR)、視黃素X受體(RXR)和過氧化物酶體增殖激活受體(PPAR)，而PPAR被認為是LXR的上游轉錄調控因子[9～12]。其中，PPARγ-LXRα通路是目前研究最深入的調控ABCA1表達和功能的信號轉導通路，其與動脈粥樣硬化發生過程密切相關[13]。本研究結果表明，作為PPARγ拮抗劑，GW9662顯著抑制了褪黑素對ABCA1和LXRα表達的促進作用，表明PPARγ參與了褪黑素對ABCA1促表達作用，并同時影響了LXRα的表達。這與之前報道的PPARγ對LXRα存在調控作用的結果一致[14]。而GSK2033 顯著抵消了褪黑素上調ABCA1作用，但其并不影響LXRα 的蛋白表達。這一方面表明，LXRα拮抗劑可能對LXRα僅發揮功能性阻斷作用；另一方面表明，LXRα 也參與了褪黑素對ABCA1 表達的調控。因此筆者推測褪黑素通過PPARγ-LXRα-ABCA1參與的途徑調節巨噬細胞ABCA1的表達。

既往研究發現，褪黑素通過與其膜受體MT1和MT2或核受體相互作用，從而調節哺乳動物的一些生理功能[15]。而本研究結果表明，褪黑素膜受體MT1和MT2都不參與褪黑素誘導的ABCA1表達。Cecon等[16]研究認為，褪黑素作為親脂性激素，可以進入細胞直接與核轉錄因子相互作用，而不經過細胞的膜受體。Zhang等[17]研究表明，褪黑素核受體與PPAR γ交互作用可能影響體外培養細胞的部分功能表達。因此筆者推測，褪黑素可能通過核受體而非膜受體參與調節ABCA1的表達。

綜上所述，褪黑素可劑量依賴性的上調巨噬細胞ABCA1的表達，PPARγ-LXRα通路參與了褪黑素對ABCA1表達的調節作用，且該調節作用不依賴褪黑素膜受體。