復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療犬細(xì)小病毒病及對犬腸黏膜的修復(fù)作用

李珍珍，關(guān) 璐，朱兆榮,2*，劉 娟,2，3*

(1.西南大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市高校獸醫(yī)科學(xué)工程研究中心中獸藥創(chuàng)新實驗室，重慶 榮昌 402460；3.西南大學(xué) 醫(yī)學(xué)研究院，重慶 榮昌 402460)

犬細(xì)小病毒病(canine parvovirus disease)是由犬細(xì)小病毒(canine parvovirus,CPV)引起的急性傳染病(犬第二大傳染病)，能夠?qū)е掠兹畡×覈I吐、出血性腸炎、血性水樣糞便、脫水、白細(xì)胞顯著減少和心肌炎等癥狀[1-2]。目前，該病無有效的治療方法，臨床上主要采用對癥治療配合高免血清和單克隆抗體治療為主。當(dāng)犬細(xì)小病毒侵入機體時，機體發(fā)生炎癥反應(yīng)，犬血清中促炎因子TNF-α、IL-1、IL-2水平增加；腸黏膜產(chǎn)生大量炎癥因子、炎癥介質(zhì)如IL-4、IL-5、IFN-γ等，損傷腸上皮細(xì)胞，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞調(diào)亡，與凋亡細(xì)胞相鄰的上皮細(xì)胞不能有效地封閉細(xì)胞所留下的空間，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高。該病中獸醫(yī)學(xué)辨證為濕熱泄瀉，由疫癘之氣侵害機體，入侵脾胃，導(dǎo)致脾清陽不升而瀉，胃濁陰不降而吐。治宜清熱解毒，健脾燥濕、涼血止血[3]。

復(fù)方苦芩是根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床辨證論治的原則，選用苦參、黃芩、白頭翁、黃芪、金銀花等組成的中藥復(fù)方，前期試驗表明，復(fù)方苦芩具有清熱利濕、止痢的作用[4]。中醫(yī)針灸可調(diào)節(jié)臟腑機能，對胃腸道的損傷有著修復(fù)和治療作用，研究表明，針灸可以通過改善小腸免疫達到提高全身免疫的功效。脾俞穴和天樞分別歸屬太陽膀胱經(jīng)和足陽明胃腸經(jīng)，是治療胃腸疾病的重要穴位，小腸俞具有外散小腸腑之熱的功效，交巢穴可以有效治療脾虛泄瀉，對脾胃有一定的療效[5-6]。本試驗旨在應(yīng)用復(fù)方苦芩結(jié)合針灸脾俞、小腸俞、天樞、交巢穴等4個穴位治療犬細(xì)小病毒病；通過觀察病犬腸黏膜的病理變化，對比不同治療方案，測定犬血清以及腸黏膜中的炎性因子，探究其對腸黏膜的修復(fù)作用，以探討復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療犬細(xì)小病毒病的療效。

1 材料與方法

1.1 毒株與細(xì)胞犬細(xì)小病毒CPV-2，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)彭廣能惠贈，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)P2生物安全實驗室保存；貓腎細(xì)胞(F81)，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏中心昆明細(xì)胞庫提供(編號KCB-2006104YJ)。

1.2 實驗動物40～60日齡中華田園犬180只，雌雄各半，體質(zhì)量(1±0.5)kg，由西南大學(xué)榮昌校區(qū)實驗動物中心提供，均接種過狂犬疫苗，左旋咪唑驅(qū)蟲，隔離觀察1周，確認(rèn)健康無病且營養(yǎng)狀態(tài)良好后用于試驗。

1.3 主要藥品及試劑黃芩、苦參、金銀花、白頭翁、廣藿香等購自重慶榮昌縣石家大藥房；黃芪多糖注射液(批號：20150318)購自重慶天龍牧業(yè)科技有限公司；犬IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、TNF-α和IFN-γ試劑盒(批號：201512)，均購自上海瑤韻生物制品有限公司。

1.4 主要儀器Nicolet iS50型紅外光譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；SE-2000型Nikon倒置顯微鏡，日本Nikon公司；3111型隔水式二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Electron Corporation USA；SW-CJ-2F型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司)DC-NSG-10型多功能提取濃縮機組，上海達程實驗設(shè)備有限公司；Bio-Rad Model 680 Microplate Reader，美國Bio-Rad Laboratories，Inc。

1.5 復(fù)方苦芩注射液制備與鑒定復(fù)方苦芩注射液制備方法：取黃芩167 g、苦參50 g、金銀花167 g、白頭翁133 g、廣藿香117 g備用。將廣藿香加10倍量的水浸泡4 h，加熱回流提取4 h，收集藿香揮發(fā)油；將廣藿香藥渣與其余生藥加水合煎3次，每次30 min，合并濾液，濃縮至生藥1.0 g/mL；加乙醇使含醇量為60%，靜置過夜，過濾，上清液回收乙醇至無醇味。濃縮至生藥0.5 g/mL，加蒸餾水至生藥1.0 g/mL，冷藏，過濾，濾液濃縮至生藥0.25 g/mL；加乙醇使醇量達85%，冷藏，過濾，濾液回收乙醇至無醇味。加注射用水至生藥1.0 g/mL，加藿香揮發(fā)油，按注射液要求調(diào)整為等滲藥液，pH 7.0。用近紅外光譜測定復(fù)方苦芩中的主要有效活性成分：將200 mg溴化鉀經(jīng)過烘干脫水置于瑪瑙研缽中研磨5 min，進行充分研磨至200目左右，將研磨好的粉末轉(zhuǎn)入磨具內(nèi)，在15～20 MPa的壓力下壓片1 min，得到透明錠片；用毛筆將復(fù)方苦芩注射液均勻涂刷在薄片上，晾干，在反面同樣涂刷，放置待晾干；同法制得溴化鉀空片作為參比。在程序內(nèi)設(shè)定測量背景，將樣品放置在儀器內(nèi)，開始測量，譜圖處理。

1.6 犬細(xì)小病毒液制備用CPV感染正常貓腎細(xì)胞(F81)，置于5%CO2培養(yǎng)箱37℃吸附90 min，PBS清洗細(xì)胞，加維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察細(xì)胞病變(CPE)，當(dāng)80%以上細(xì)胞發(fā)生CPE時(幾乎全部脫落)，連同細(xì)胞和培養(yǎng)液置-80℃反復(fù)凍融3次以裂解細(xì)胞，離心收集上清液，分裝至2 mL 凍存管，-20℃保存，備用于模型建立。

1.7 動物分組及處理

1.7.1動物分組 將犬隨機分為空白組、模型組、陽性藥物組、復(fù)方苦芩組、針灸組、復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組，每組30只。空白組犬灌服生理鹽水5 mL/kg，其余各組犬灌服犬細(xì)小病毒液5 mL/kg(5×105PFU/mL)建立犬細(xì)小病毒病模型；參照文獻[7]，犬若表現(xiàn)精神萎靡，采食量下降且不喜動，隨后出現(xiàn)嘔吐腹瀉等癥狀，糞便呈番茄色水樣稀便，并伴有腥臭味，用CPV試紙檢測呈陽性，說明犬細(xì)小病毒病模型成功。造模成功后，模型組與空白組注射生理鹽水1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，連續(xù)治療5 d；復(fù)方苦芩組犬肌肉注射復(fù)方苦芩注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，連續(xù)治療5 d；復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組犬肌肉注射復(fù)方苦芩注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，連續(xù)治療5 d，并在選定穴位上施針，每次留針20 min；針灸組在選定穴位上施針，每次留針20 min，2次/d；陽性藥物組肌肉注射黃芪多糖注射液1.5 mL/kg，2次/d(8:00,14:00各1次)，連續(xù)治療5 d。收集治療效果，采取血清備存待測，每組隨機選取5只麻醉后處死，采小腸腸段保存并制作病理切片。

1.7.2針灸治療穴位的選取 選取脾俞、小腸俞、天樞、交巢等4個穴位作為治療穴位。脾俞穴位于犬倒數(shù)第二肋間，背最長肌與髂肋肌之間的肌溝中，左右各1穴；小腸俞穴位于犬第六腰椎橫突末端相對的髂肋肌溝中，左右側(cè)各1穴；天樞穴位于犬臍眼旁開3 cm，左、右各1穴；交巢穴位于犬尾根與肛門間凹陷中，1穴。

1.7.3療效標(biāo)準(zhǔn)制定 參考犬細(xì)小病毒病診療效果[8]制定。用藥72～96 h后體溫、精神、食欲恢復(fù)正常，小便正常，血便停止、糞便成形等視為痊愈；用藥48 h后體溫、精神、食欲均基本恢復(fù)正常，嘔吐、腹瀉臨床癥狀明顯減輕視為有效；用藥96 h后臨床癥狀無改善或惡化、死亡視為無效。

1.8 臨床指標(biāo)觀察觀察每組犬體溫變化，記錄退燒時間；觀察每組犬排便情況，記錄腹瀉便血天數(shù)；觀察每組犬食欲變化，記錄嘔吐消失時間，分析治療效果。

1.9 犬血清中炎性因子含量的測定分別于1，2，4，5 d無菌采集犬后肢靜脈凝血血樣，4℃冰箱過夜，4 000 r/min離心10 min，吸取血清，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說明測定犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α水平。

1.10 檢測十二指腸組織結(jié)構(gòu)試驗5 d時，各試驗組隨機挑選5只犬，各組犬分別取距幽門2 cm處十二指腸5～6 cm，常規(guī)方法制作石蠟切片，進行蘇木伊紅(HE)染色，用光學(xué)顯微鏡進行鏡檢。

1.11 犬腸黏膜中炎性因子含量的測定在試驗5 d 時，各試驗組隨機挑選5只犬，分別取2 g小腸組織，加入其5倍量的PBS(pH 7.4)，將標(biāo)本充分勻漿。2 000 r/min離心20 min左右，收集上清液，嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒說明測定IL-4、IL-5、IFN-γ水平。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方苦芩注射液紅外光譜鑒定結(jié)果圖1為復(fù)方苦芩注射液紅外圖譜，3 002處為亞甲基反對稱伸縮振動吸收峰；2 322,2 007和1 845處為三鍵和累積雙鍵伸縮振動吸收峰；1 553處為苯環(huán)骨架振動吸收峰，是黃酮類成分吸收峰；1 276和1 209為醚鍵伸縮振動吸收峰，為生物堿類吸收峰；1 149和1 060 處為多糖類羥基振動吸收峰；且956,881,814,739,679處也均為多糖類羥基振動吸收峰。結(jié)果提示,該注射液含有黃酮類、生物堿類、多糖類物質(zhì)。

圖1 復(fù)方苦芩注射液紅外圖譜

2.2 臨床治愈情況空白組犬精神狀態(tài)佳，飲食欲良好，糞便正常，被毛整潔。模型組犬初期精神萎靡、采食量逐漸減少甚至廢絕、隨后出現(xiàn)嘔吐、腹瀉等癥狀，中期排番茄色水樣稀便，并伴有腥臭味，后期便血且惡臭味加重。采用不同方案治療后，可看出復(fù)方苦芩組的病犬退熱時間和嘔吐消失時間最快，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組犬腹瀉癥狀消失最快(表1)。同時,治療5 d后對比各組犬，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組犬治愈率最高達80%，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組犬癥狀明顯減輕，體溫、精神、食欲均恢復(fù)正常；陽性藥物組、復(fù)方苦芩組犬和針灸組犬治愈率分別為73%,67 %和37 %(表2)。

表1 各組臨床指標(biāo)觀察結(jié)果 d

表2 各組臨床治愈結(jié)果

2.3 對CPV病犬十二指腸組織病理學(xué)觀察結(jié)果由圖2可看出，空白組腸絨毛結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，絨毛表面覆蓋的單層柱狀上皮細(xì)胞完整，中央乳糜管清晰可見。模型組十二指腸絨毛脫落，且萎縮壞死，長度變短，絨毛界限不分明，中央乳糜管消失。陽性藥物組無絨毛脫落，絨毛輕度萎縮，界限清晰，上皮細(xì)胞輕度變性、壞死。復(fù)方苦芩組少許絨毛脫落，絨毛輕度萎縮，界限較清晰，上皮細(xì)胞輕度變性。針灸組絨毛脫落較多，絨毛中度萎縮，界限較其他治療組模糊，上皮細(xì)胞輕度變性。復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組少許絨毛脫落，絨毛輕度萎縮，界限清晰，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整，固有形態(tài)清晰。各治療組相對模型組均有好轉(zhuǎn)趨勢。

A.空白組;B.模型組;C.陽性藥物組;D.復(fù)方苦芩組;E.針灸組;F;復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組

2.4 對犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α的影響由圖3,4,5可知，與空白組比，試驗1,2,4,5 d時模型組犬血清中IL-1、IL-2、TNF-α含量差異均極顯著升高(P<0.01)。與模型組比，在試驗1 d時復(fù)方苦芩組和針灸組IL-1含量差異顯著降低(P<0.05)，試驗2,4,5 d時復(fù)方苦芩組、針灸組、復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組和陽性藥物組IL-1含量差異均極顯著降低(P<0.01)；試驗1,2,4,5 d時復(fù)方苦芩組、針灸組、復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組和陽性藥物組IL-2含量差異均顯著降低(P<0.05)；試驗1,2,4,5 d時復(fù)方苦芩組、針灸組、復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組TNF-α含量差異均極顯著降低(P<0.01)。與陽性藥物組比,試驗5 d 時復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組IL-1、TNF-α含量差異極顯著降低(P<0.01)，IL-2含量差異顯著降低(P<0.05)。

A.1 d;B.2 d;C.4 d;D.5 d。與空白組比較,**示P<0.01；與模型組比較，Δ示P<0.05，ΔΔ示P<0.01；與陽性藥物組比較，#示P<0.05，## P<0.01。下同

圖4 各組犬血清中IL-2的影響

圖5 各組犬血清中TNF-α的影響

2.5 對犬腸黏膜中IL-4、IL-5、IFN-γ的影響從圖6，7，8可知，與空白組比，試驗1，2，4，5 d時，模型組犬腸黏膜中IL-4、IL-5、IFN-γ含量差異極顯著升高(P<0.01)。與模型組比，試驗1，2，4，5 d時復(fù)方苦芩組、針灸組和復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組犬腸黏膜中IL-4含量均差異極顯著降低(P<0.01)；試驗1，2，4，5 d 時復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組與試驗2，4，5 d時針灸組犬腸黏膜中IL-5含量均差異極顯著降低(P<0.01)；復(fù)方苦芩組、針灸組試驗1 d時IFN-γ含量均差異顯著降低(P<0.05)，復(fù)方苦芩組、針灸組在試驗2，4，5 d時IFN-γ含量均差異極顯著降低(P<0.01)；與陽性藥物組比，于試驗5 d時復(fù)方苦芩結(jié)合針灸組IL-4、IL-5、IFN-γ含量差異極顯著降低(P<0.01)。

圖6 各組對犬腸黏膜中IL-4的影響

圖7 各組對犬腸黏膜中IL-5的影響

3 討論

復(fù)方苦芩由黃芩、苦參、白頭翁、梔子、金銀花等中藥組成，通過傅里葉紅外光譜對復(fù)方苦芩注射液進行檢測，測得總多糖、總黃酮、總生物堿等3種主要有效成分，通過前期試驗結(jié)果表明，此3種成分對犬細(xì)小病毒病犬小腸組織均有一定的保護作用[9]。據(jù)報道，復(fù)方苦芩具有清熱解毒、涼血止痢、健脾利濕之功效，對犬細(xì)小病毒病具有良好的防治效果[10-12]。針灸具有疏通經(jīng)絡(luò)、調(diào)和陰陽、扶正祛邪之功。本試驗結(jié)果表明，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療能持久有效地緩解病犬臨床癥狀，且對比單獨使用復(fù)方苦芩、針灸治療，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療腹瀉癥狀消失快，治愈率最高，達80%，具有明顯減弱腸道炎癥反應(yīng)的作用，從而達到治療犬細(xì)小病毒病的功效。

犬細(xì)小病毒病腸炎型腸道損壞嚴(yán)重，導(dǎo)致小腸黏膜脫落。小腸黏膜上的小腸絨毛有過濾物質(zhì)及增強對物質(zhì)的吸收等作用，其中由小腸絨毛、腸黏膜基底膜及其表面的黏液層等組成的腸黏膜屏障是腸道防御機制最重要的環(huán)節(jié)，當(dāng)腸黏膜屏障受到破壞時，腸道內(nèi)大量細(xì)菌和毒素將通過小腸進入機體內(nèi)，從而引發(fā)各種炎性疾病[13]。相關(guān)研究結(jié)果表明，中草藥能有效保護小腸腸黏膜屏障，降低其通透性，增強腸黏膜屏障的功能[14]。電針天樞、交巢等穴位對結(jié)腸局部的腦腸肽紊亂有調(diào)節(jié)作用，同時能夠增強腸黏膜屏障免疫功能，有效防止腹瀉的發(fā)生[15-16]。本試驗結(jié)果表明，復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療對病犬小腸絨毛膜具有較好的修復(fù)作用，可防止小腸絨毛膜脫落變性，萎縮壞死，保護小腸上皮細(xì)胞的固有形態(tài)。推測其原因可能是在復(fù)方苦芩對腸黏膜修復(fù)作用的基礎(chǔ)上，針灸治療進一步發(fā)揮了調(diào)節(jié)全身免疫，增強機體腸黏膜屏障免疫功能的作用。

圖8 各組對犬腸黏膜中IFN-γ的影響

IL-1主要由活化的巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生，是發(fā)熱和炎癥的強誘導(dǎo)劑，具有誘導(dǎo)合成環(huán)氧合酶2型(COX-2)、2型磷脂酶A和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶等強效炎癥介質(zhì)的作用[17]；IL-2主要由輔助性T細(xì)胞產(chǎn)生，它是T細(xì)胞必不可少的生長因子，對T細(xì)胞的增殖、效應(yīng)細(xì)胞和記憶細(xì)胞的產(chǎn)生至關(guān)重要[18]；TNF-α主要是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生，是一種在正常和病理生物學(xué)過程中起重要作用的促炎細(xì)胞因子，在調(diào)節(jié)不同組織和復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用[19]。試驗中，模型組的促炎因子IL-1、IL-2、TNF-α大量增加，治療后各治療組都有不同程度的下降，試驗5 d后，基本都穩(wěn)定在空白組的正常值左右，減輕了機體炎癥。

當(dāng)腸道受到CPV給的刺激后，腸黏膜固有層分泌大量的細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IFN-γ等；IL-4主要由Th2細(xì)胞、先天淋巴細(xì)胞和髓系細(xì)胞產(chǎn)生，是B細(xì)胞的T細(xì)胞衍生生長因子[20]；IL-5由活化的Th2和肥大細(xì)胞產(chǎn)生，是炎癥調(diào)節(jié)因子，能刺激嗜酸粒細(xì)胞增殖、分化及活化；對病原體的反應(yīng)中具有細(xì)胞和組織特異性功能[21]。IFN-γ由Th細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，它通過增強抗原的加工和提呈，增加白細(xì)胞的轉(zhuǎn)運，誘導(dǎo)抗病毒狀態(tài)，增強抗微生物功能，影響細(xì)胞增殖和凋亡等方面發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[22]；IFN-γ屬于促炎因子的一種，可啟動炎癥反應(yīng)。本試驗中，模型組抗炎因子IL-4、IL-5和促炎因子IFN-γ大量增加，在經(jīng)過治療以后，各藥物組均有不同程度下降，說明復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療可以有效的降低因CPV侵入機體破壞腸黏膜產(chǎn)生的大量細(xì)胞因子，促進抗炎因子與促炎因子恢復(fù)平衡，抑制炎癥發(fā)展，減輕腸黏膜的炎性反應(yīng)。

復(fù)方苦芩結(jié)合針灸治療可提高犬細(xì)小病毒病的治愈率，恢復(fù)其腸黏膜的形態(tài)，降低血清以及腸黏膜的炎性因子，以達到對腸黏膜的修復(fù)。