茶多酚通過NF-κB通路緩解LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎性反應

賈紅豆

(黑龍江八一農墾大學 生物技術中心，黑龍江 大慶163319)

乳腺炎是奶牛中最常見的傳染病之一。該病的特征是細菌和真菌感染引起的乳腺組織的炎癥反應，導致牛奶產量和品質下降，從而給奶牛養殖業帶來嚴重的經濟損失[1-2]。此外，乳腺炎還存在治療費用高昂和廣泛的流行等問題，嚴重影響患病奶牛的福利和健康[3]。牛乳腺上皮細胞是牛奶蛋白合成和分泌的主要部位，也是抵抗病原細菌的主要防線。一旦病原菌進入乳房，就會誘導促炎性細胞因子產生，并且導致局部乳腺炎癥。牛乳腺炎最常見的致病性病原體是革蘭陰性菌大腸桿菌和肺炎克雷伯桿菌以及革蘭陽性菌無乳鏈球菌、乳房鏈球菌和金黃色葡萄球菌[4]。革蘭陰性細菌釋放的脂多糖(LPS)被認為是牛乳腺上皮細胞炎癥的重要刺激因素[5-6]。研究發現，LPS可以激活NF-κB信號通路，誘導IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細胞因子的釋放[7]。反過來，這些細胞因子進一步加重了與乳腺炎有關的病理和炎癥反應。多年以來，乳腺炎的治療主要采用抗生素治療，早期效果良好，但隨著時間的流逝，致病菌會在體內產生耐藥性和更多的藥物殘留，嚴重危及奶牛及人類健康。此外，疫苗的預防效果不理想，對乳腺炎的預防和治療也提出了更高的挑戰，因此，迫切需要尋找和開發治療奶牛乳腺炎的新藥物。

近年來的研究發現，中藥對奶牛乳腺炎性具有明顯的治療效果，而且能避免藥物殘留等問題。因此，篩選出具有治療奶牛乳腺炎的中藥，并闡明其作用機理具有十分重要的臨床意義。茶多酚是綠茶提取物，含有許多生物學功能的關鍵成分，具有包括抗炎、抗氧化和抗癌等作用。研究發現，茶多酚可以通過抑制NF-κB通路發揮抗炎作用[8]。目前，茶多酚對奶牛乳腺炎是否具有防治作用尚不清楚，本試驗通過研究茶多酚對奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應的保護作用，并闡明其潛在的分子機制，為篩選治療奶牛乳腺炎的藥物提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑DMEM/F12培養基購自SIGMA(D8437-500ML)；CCK-8試劑盒購自Dojindo, Kumamoto(CK04)；IKKβ激酶活性檢測試劑盒購自GenMed Scientifics Inc.(GMS50162.4)；RNAiso Plus購自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(D9108A)；反轉錄試劑盒購自TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.(RR047A)；蛋白裂解液購自Beyotime Institute of Biotechnology(P0013)；BCA試劑盒法購自Applygen Technologies(P1511)；p-IκB α購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-271980)；IκBα購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166588)；p65購自Santa Cruz Biotechnology(sc-8008)；β-actin購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-166748)；p-p65購自 Santa Cruz Biotechnology(sc-47778)。

1.2 試驗分組與處理使用混有10%胎牛血清的DMEM/F12培養基在37℃、5%CO2的條件下對奶牛乳腺上皮細胞(MAC-T)進行培養。(1)對照組:MAC-T細胞在無血清培養基中培養12 h，更換無血清培養基繼續培養6 h。(2)LPS組:MAC-T細胞在無血清培養基中培養12 h，更換含有1 mg/L LPS無血清培養基培養6 h。(3)茶多酚組:MAC-T細胞在含有茶多酚(50，100，200 mg/L)的無血清培養基培養12 h，更換無血清培養基培養6 h；(4)茶多酚+LPS組：MAC-T細胞在含茶多酚(50，100，200 mg/L)的無血清培養基培養24 h，更換含1 mg/L LPS的無血清培養基培養6 h。

1.3 細胞活力檢測使用CCK-8試劑盒(Dojindo,Kumamoto,Japan)檢測細胞活力。將細胞10× 104個/mL接種于96孔板，細胞按照1.2處理后，添加CCK-8試劑孵育4 h，之后用酶標儀(Thermo Fisher Scientific,Grand 79 Island,NY)測D450 nm值。

1.4 IKK-β活性測定MAC-T細胞經處理后，IKK-β活性采用IKK-β激酶活性檢測試劑盒(GMS50162.4;GenMed Scientifics Inc.,Wilmington,DE)方法進行檢測。

1.5 RNA的提取、反轉錄及實時熒光定量PCRMAC-T細胞經處理后，利用RNAiso Plus(TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.,Dalian,China)提取細胞中的RNA，隨后利用反轉錄試劑盒(RR047A,TaKaRa Biotechnology Co.Ltd.)將RNA反轉錄成cDNA，之后采用7500 real-time PCR系統檢測各目標基因的mRNA表達量。利用2-ΔΔCt計算目標基因的mRNA表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.6 蛋白提取和Western blotMAC-T細胞經處理后，使用蛋白裂解液(P0013,Beyotime Institute of Biotechnology,Jiangsu,China)提取總蛋白。采用BCA試劑盒法(P1511,Applygen Technologies,Beijing,China)檢測蛋白質量濃度。使用SDS-PAGE分離蛋白質樣品，并電泳轉移到PVDF膜上，之后將PVDF膜與特異一抗(p-IκB-α，IκB-α，NF-κB，p-NF-κB和β-actin)及相應的二抗孵育后檢測蛋白條帶。

2 結果

2.1 茶多酚對MAC-T細胞活力的影響為了檢測茶多酚對MAC-T細胞是否毒性作用，采用CCK-8試劑盒檢測細胞活力。結果顯示，50，100，200 mg/L茶多酚對MAC-T細胞的活力沒有顯著性影響(圖1)。后續試驗選用無毒性影響的中劑量100 mg/L 茶多酚。

圖1 茶多酚對MAC-T細胞活力的影響

2.2 茶多酚對IKK-β活性的影響與對照組相比，LPS組細胞中IKK-β活性顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，茶多酚+LPS組中IKK-β活性顯著降低(P<0.05)(圖2)。

*示P<0.05，下同

2.3 茶多酚對p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白表達量的影響與對照組相比，LPS組細胞中p-IκB-α/IκB-α比值顯著升高(P<0.05)(圖3A，B)。與LPS組相比，茶多酚+LPS組中p-IκB-α/IκB-α比值顯著下降(P<0.05)(圖3A，B)。與p-IκB-α/IκB-α變化趨勢一致，LPS組細胞中p-NF-κB/NF-κB比值顯著高于對照組(P<0.05)(圖3A，C),而茶多酚+LPS組中p-NF-κB/NF-κB比值顯著低于LPS組(P<0.05)(圖3A，C)。

A.p-IκB-α、IκB-α、p-NF-κB和NF-κB蛋白條帶；B.p-IκB-α和IκB-α的比值；C.p-NF-κB和NF-κB的比值

2.4 茶多酚對TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達量的影響與對照組相比，LPS組細胞中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達量顯著升高(P<0.05)；與LPS組相比，茶多酚+LPS組中TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA表達量顯著降低(P<0.05)(圖4)。

A.TNF-α mRNA表達量；B.IL-6 mRNA表達量；C.IL-1β mRNA表達量

3 討論

乳腺炎以乳腺組織損傷為特征，且促炎性細胞因子(主要是TNF-α、IL-6和IL-1β)水平升高。LPS是大腸桿菌的主要毒力因子，在奶牛乳腺炎的發病過程中發揮重要作用。據報道，NF-κB是介導LPS誘導炎性細胞因子產生的主要信號通路[9]。通常情況下，抗生素是治療乳腺炎的主要藥物，但是由于耐藥性和殘留物導致牛奶質量下降和產量下降。因此，尋求安全有效的抗炎藥物是緩解奶牛乳腺炎的重要方法。茶多酚是茶葉提取物，因其具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等生物活性[8]，己被廣泛應用于醫藥行業和獸醫領域。本試驗結果表明，茶多酚可以通過抑制NF-κB通路降低TNF-α、IL-6和IL-1β的產生而保護奶牛乳腺上皮細胞免受LPS誘導的炎性損傷。

炎性細胞因子的過度分泌在奶牛乳腺炎的發病過程中具有關鍵作用。細胞因子作為細胞間化學信使參與調節免疫穩態和炎癥反應[10]。研究發現，大腸桿菌可導致奶牛乳腺炎誘導TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎細胞因子mRNA表達量增加[11]。體外LPS刺激乳腺上皮細胞也可以導致這些促炎細胞因子表達量上升[12-13]。因此，減少促炎性細胞因子的產生可能是治療乳腺炎的有效策略。據報道，茶多酚可以降低大鼠心肌細胞中促炎細胞因子TNF-α mRNA表達量[8]。本試驗結果表明，茶多酚預處理可以顯著降低奶牛乳腺上皮細胞TNF-α、IL-6和IL-1β mRNA的表達量，減少促炎細胞因子的產生而緩解LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞炎性反應。

NF-κB蛋白是一種核轉錄因子，該蛋白的激活在乳腺炎的發展中具有十分重要的作用[14-15]。當細胞受到各種化學和機械信號刺激時，IKK-β被迅速激活，導致IκB-α磷酸化和蛋白酶體介導的降解[16]，然后將NF-κB磷酸化并轉移到細胞核中，從而誘導細胞因子的轉錄[17]。因此，抑制NF-κB的激活可能是治療乳腺炎的關鍵步驟。研究發現，茶多酚可以降低心肌細胞中NF-κB的結合活性[8]，從而減少促炎細胞因子的產生。本試驗發現，茶多酚可以減少LPS誘導的IKK-β的活性，并降低IκB-α和NF-κB的磷酸化水平，從而抑制NF-κB信號通路的激活。這些結果表明，茶多酚預處理可改善LPS誘導的NF-κB通路的激活，這可能有助于緩解奶牛乳腺上皮細胞的炎性反應。

本試驗結果表明，茶多酚可通過抑制NF-κB通路的激活而緩解LPS誘導的乳腺上皮細胞的炎性反應，說明茶多酚可能成為防治奶牛乳腺炎的藥物。