丹參多糖對氟苯尼考導致的肉雞生長抑制和肝功能損傷的緩解作用

韓 超，李淑穎，耿玉萌，史萬玉，包永占

(河北農業大學 中獸醫學院，河北 保定 071001)

藥物性肝損傷(drug induced liver injury，DILI)是指人體暴露于常規劑量或高劑量藥物后，因藥物本身或其代謝產物對肝臟的直接毒性，或人體對藥物或其代謝產物產生過敏或代謝特異質反應而導致的肝臟損傷，是肝生化異常與急性肝衰竭(acute liver failure，ALF)的常見原因之一[1-3]。在所有引起藥物性肝損傷的因素中，抗生素被報道的最多，研究發現青霉素類、氯霉素類和大環內酯類等都是極易引起藥物性肝損傷的抗生素種類[4]。隨著有關抗生素引起肝毒性的報道越來越多，人們不僅關注抗生素對人類的肝臟毒性，也開始關注抗生素對動物的肝毒性。近年來，已有多種抗生素被報道能夠引發動物的肝毒性[5]，這其中就包括氟苯尼考。氟苯尼考是一種廣譜的動物抗生素[6]，其具有很好的抗菌作用，對多種革蘭陰性菌和陽性菌有抗菌作用。據報道，高劑量的氟苯尼考可通過抑菌作用加重肝損傷。本實驗室前期研究也發現，1日齡開始給與氟苯尼考能顯著抑制雛雞早期的增重，損傷雛雞的造血功能，同時對雛雞的肝臟功能造成損傷[7]。

丹參多糖是丹參藥材中重要藥效成分之一。現代研究發現，植物多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、免疫調節、降血糖及降血脂等作用。丹參多糖作為植物多糖的一種也具有以上藥效活性[8]。近年來，有多篇報道丹參多糖對肝臟損傷有較好的緩解作用，姚瑩華等[9]發現，丹參多糖能降低LPS誘導的急性肝損傷模型小鼠肝組織中MDA含量，升高GSH含量，降低血清ALT含量，從而達到緩解肝臟損傷的作用；盧艷嫻等[10]研究發現，丹參多糖通過開放肝竇內皮細胞窗孔，改善肝竇微循環，達到保護肝臟的作用。本實驗室對丹參多糖的保肝效果進行了研究，前期研究發現，丹參多糖在體內外均能有效抑制炎癥反應，并通過減少炎性因子的釋放達到緩解免疫性肝損傷的效果[11-12]；丹參多糖還可以通過抑制炎癥通路TRL4/MyD88[13]、NF-κB和趨化因子CXCL-10[14-15]的活性來降低炎癥因子的釋放達到抑制炎癥反應的作用，進而緩解免疫性肝損傷。此外，丹參多糖能有效調控免疫性肝損傷的小鼠肝臟內氧化應激[15-16]，抑制肝細胞凋亡[17]，進而緩解肝損傷。同時發現，丹參多糖對CCL4引起的雛雞肝臟損傷也有較好的緩解效果，丹參多糖能提高肝臟內肝藥酶活性，降低肝細胞的氧化應激而保護肝臟細胞[18]。綜上所述，丹參多糖對多種類型的肝損傷均有不錯的緩解效果，具備開發成保肝藥物的潛質。本試驗以肉雞為試驗對象，闡明丹參多糖對氟苯尼考導致的肉雞肝毒性的作用效果，這對中藥有效成分的開發、闡明抗生素毒副作用和尋求有效防治措施具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑1日齡羅斯308肉雞，購自河北大午公司；氟苯尼考溶液購自山東德州神牛藥業有限公司；谷氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)等生化試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所；CYP1A1和CYP2H1 ELISA試劑盒，購自上海恒遠生物技術有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒等，購自北京普洛麥格生物技術有限公司。

1.2 試驗分組40只1日齡的羅斯308肉雞被隨機分成A、B、C、D 4組，每組10只，A組雛雞從1日齡開始正常飲水和飼喂飼料；B組雛雞從1日齡開始往飲用水中添加0.15 g/L(獸藥典推薦劑量)的氟苯尼考(FFC)，連用5 d;C組雛雞從1日齡開始分別往飲用水中添加0.15 g/L(獸藥典推薦劑量)的氟苯尼考(FFC)和5.00 g/L的丹參多糖(SMPs)，連用5 d;D組雛雞從1日齡開始往飲用水中添加5.00 g/L的丹參多糖(SMPs)，連用5 d。5 d后，各組雛雞自由飲用自來水，正常飼喂飼料；飼養至42日齡，試驗雞翅下靜脈采血，并處死采取雞的肝臟。

1.3 測定增重、肝臟指數及料肉比各組1日齡雛雞記錄初始體質量，飼喂到42日齡后再次對各組肉雞稱重，然后計算兩者差值作為各組雛雞的體質量增加量；并在各組隨機選取10只肉雞處死，摘取其肝臟稱重計算肝指數，肝指數=肝臟質量(g)/體質量(g)×100%。并計算整個飼養期各組的料肉比，料肉比=每組肉雞總消耗飼料量(kg)/每組肉雞總增重(kg)。

1.4 雞全血中白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(RGB)和血小板(PLT)的含量測定采取各組42日齡雞血液置于抗凝管，將血液與抗凝劑充分混合，利用全自動血液細胞計數儀檢測全血中WBC、RBC、RGB和PLT的含量。

1.5 檢測雛雞血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量采取各組雞血液置于促凝管，將其傾斜置于4℃冰箱1 h，然后低速離心分離得到血清。利用分光光度計測定D值，并計算各組雛雞血清中ALT、AST、MDA、NO、SOD和CAT的含量。

1.6 ELISA檢測肝組織中CYP1A1和 CYP2H1的含量將各組肉雞肝臟組織制作成10%的組織勻漿，離心后取上清液,用ELISA試劑盒檢測肝組織勻漿上清液中CYP1A1和CYP2H1的含量。

1.7 RT-QPCR檢測肝組織內CYP1A1 mRNA的轉錄水平使用總RNA提取試劑盒(Promega，Beijing，China)從肝臟中提取RNA，逆轉錄得到cDNA。通過實時定量熒光PCR方法檢測肝臟中CYP1A1、CYP2H1、UGT2A1、GSTT1、Nrf2、HO-1、NQO-1、P53、CytC、Caspase-3 mRNA轉錄水平。引物由TaKaRa(大連，中國)設計合成(表1)。預變性處理為95℃ 120 s，擴增進行45個循環，包括95℃ 5 s，64℃ 30 s；然后72℃ 30 s。內參基因為β-actin，由2-ΔΔCt計算每個基因的相對轉錄水平。

表1 引物序列

2 結果

2.1 氟苯尼考對肉雞增重的影響由表2可知，與空白組相比，0.15 g/L的氟苯尼考能引起雛雞增重顯著下降、肝指數的顯著升高(P<0.05)；還能增加肉雞飼養過程中的料肉比；而與氟苯尼考組相比，5.00 g/L 的丹參多糖能顯著提高肉雞的增重(P<0.05)，顯著抑制肉雞肝臟指數的增高(P<0.05)，降低肉雞飼養過程中的料肉比。

表2 各組雛雞平均增重、肝臟指數和料肉比

2.2 不同劑量氟苯尼考對雞全血中WBC、RBC、RGB和PLT含量的影響由表3可知，與空白組相比，氟苯尼考均會導致肉雞血液中RBC的數量和RGB的含量顯著降低(P<0.05)，肉雞血液中WBC數量和PLT含量卻無顯著改變(P>0.05)。而丹參多糖能顯著緩解氟苯尼考導致的肉雞血液中RBC的數量和RGB含量的降低(P<0.05)。

表3 全血中各成分的計數

2.3 丹參多糖對雞血清中生化指標含量的影響檢測肉雞血清中生化指標發現，氟苯尼考組雞血清中MDA和NO 的含量均顯著高于空白對照組血清中MDA和NO的含量(P<0.05)，氟苯尼考組雞血清中CAT顯著低于空白對照組雞血清中CAT的含量(P<0.05)；而用丹參多糖處理后能顯著緩解氟苯尼考導致的肉雞血清中MDA和NO含量的升高和CAT含量的下降(P<0.05)。各組肉雞血清中ALT、AST和SOD的含量卻沒有顯著差異(P>0.05)，結果詳見表4。

表4 各組肉雞血清中生化指標的含量

2.4 丹參多糖對肉雞肝臟內藥物代謝酶表達的影響如圖1A所示，與空白對照組組相比，氟苯尼考組肉雞肝組織中CYP1A1含量及 mRNA的轉錄水平均顯著下降(P<0.05)，而CYP2H1的含量及mRNA的轉錄水平卻沒有顯著性差異(P>0.05)；另外，我們檢測肝臟藥物代謝Ⅱ相反應中關鍵酶GSTT1和UGT2A1 mRNA的轉錄水平，結果顯示氟苯尼考能顯著降低肉雞肝組織中GSTT1 mRNA的轉錄水平(P<0.05)，而對UGT2A1 mRNA的轉錄水平沒有顯著影響(P>0.05)；丹參多糖干預后，肉雞肝組織中GSTT1 mRNA的轉錄水平顯著升高(P<0.05)(圖1B)。

A.各組雛雞肝組織中CYP1A1和CYP2H1的含量；B.各組雛雞肝組織中CYP1A1、CYP2H1、GSTT1和UGT2A1 mRNA的轉錄水平

2.5 丹參多糖對雞肝組織中Nrf2 通路關鍵因子mRNA轉錄水平的影響如圖2所示，與空白對照組相比，氟苯尼考能顯著降低肝臟中Nrf2 mRNA轉錄水平(P<0.05);而與氟苯尼考組相比，5.00 g/L的丹參多糖能顯著提高肝臟中Nrf2 mRNA轉錄水平和蛋白表達水平(P<0.05)；而HO-1和NQO-1 mRNA的轉錄水平在各組中均沒有差異(P>0.05)。

圖2 各組雛雞肝組織中Nrf2、HO-1和NQO-1的mRNA的轉錄水平

3 討論

據報道，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)氟苯尼考對7日齡以內肉雞的生長性能、造血功能以及肝臟的功能均有一定的損傷作用[7]。而到42日齡時，正常推薦治療劑量(0.15 g/L)的氟苯尼考仍顯著抑制肉雞的增重，而對造血功能和肝臟的功能損傷有所減輕。

本試驗結果表明，42日齡時，丹參多糖對氟苯尼考導致的肉雞生長抑制、肝臟功能損傷均有極好的緩解作用，基本恢復正常水平。

越來越多的證據表明，氧化應激在藥物性肝損傷中扮演重要角色。肝臟是機體重要的代謝器官，肝臟內形成很多的抗氧化系統，能夠在正常情況下維持肝臟的代謝。但過量的ROS會導致肝臟的抗氧化系統紊亂，造成氧化損傷[19-20]。為了檢測丹參多糖是否通過抑制肝細胞的氧化應激來緩解肝臟的損傷，本試驗檢測了氧化應激的標志物MDA、NO以及關鍵抗氧化酶SOD、CAT含量，結果顯示FFC誘導后，MDA、NO含量明顯地升高，說明機體內還存在一定的氧化應激；而丹參多糖干預后，肉雞肝組織中MDA和NO含量的下降表明機體的應激防御功能被激活，進而緩解肉雞肝細胞損傷。據報道，Nrf2信號通路作為協調因子，在抗氧化應激系統中起到重要的作用[21]。其通過誘導調控細胞內Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶的組成型和誘導型表達，有利于改善機體氧化應激狀態，促進細胞存活以及維持細胞的氧化還原穩態[22-23]。而本試驗結果表明，丹參多糖通過激活Nrf2及其下游蛋白的表達，改善了氟苯尼考誘導的肉雞藥物性肝損傷。此外，Nrf2作為氧化應激中的關鍵分子，可以調控下游HO-1和NQO-1等蛋白的表達，在調節細胞內脂肪積累中起到重要的作用[24-25]，本試驗結果發現丹參多糖能夠提高HO-1和NQO-1的表達水平，說明SMPs有增強細胞抗氧化的能力并能調控肝細胞的脂肪代謝。

藥物本身或代謝產物的直接肝細胞損傷，導致肉雞肝損傷最常見的就是抗生素、黃曲霉毒素、重金屬等，它們的代謝產物大多都具有肝毒性[26]。藥物在肝臟中需進行兩步反應，即Ⅰ相和Ⅱ相反應。Ⅰ相反應:將藥物進行水解、氧化、還原，產生代謝產物，主要的代謝酶是細胞色素 P450(CYP)，CYP1A1 及 CYP2H1 等都是導致藥物性肝損傷相關的關鍵性氧化酶[27]。因此，肝細胞內肝藥酶的含量對肝臟的解毒能力有直接的關系。我們的研究結果發現：42日齡時，氟苯尼考對肉雞肝臟內肝藥酶的活性仍有一定的抑制作用，而丹參多糖干預后能顯著恢復肝臟內肝藥酶的活性。在Ⅱ相反應中，谷胱甘肽 S-轉移酶(glutathione S-transferases，GSTs)是一組與肝臟解毒功能有關的酶，其谷胱甘肽和自由基結合，促進有毒物質從體內清除，降低藥物潛在毒性，GSTs 功能障礙會導致急性肝損傷的發生[28]。當肝臟嚴重損傷時，GST 和 GSH 將從 肝細胞質中釋放到血漿中，導致肝細胞質中GST 活性降低[29]。因此，臨床上對肝組織中GSTs 活性水平的監測可能是診斷DILI 的潛在策略。我們的研究發現氟苯尼考能顯著抑制GSTT1 mRNA轉錄水平，說明氟苯尼考能夠抑制肝臟代謝藥物的能力，造成大量的藥物代謝物在肝臟中聚集，進而損傷肝臟的功能。而丹參多糖能夠提高GSTT1的含量，恢復肝臟功能。除此之外，尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP glucuronosyl transferase，UGT)作為Ⅱ相反應中另外一個重要的轉移酶，多項研究表示UGTs基因與藥物性肝損傷具有顯著相關性[30-31]。本研究發現各組肉雞肝組織UGT2A1的表達沒有顯著差異。這可能是42日齡時，氟苯尼考對肉雞肝臟功能損傷較輕微，沒有引起尿核苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶活性的顯著改變。