二烯丙基二硫化物對MDCC-MSB-1細胞凋亡的影響

張佩琪,周鵬飛，葉正欽，劉進輝，王宜平，紀春曉

(湖南農業大學 動物醫學院 湖南省獸藥工程技術研究中心，湖南 長沙410000)

雞馬立克病(Marek's disease,MD)一直都是影響家禽健康的主要疾病,該疾病的嚴重程度不同，范圍從慢性周圍神經病變(以脫髓鞘和癱瘓為特征)到急性癌癥，其中存在多個內臟淋巴瘤，是世界范圍內家禽經濟上最廣泛的重要疾病之一[1]。20世紀60年代后期以來，規模化的家禽生產系統依賴于疫苗來控制疾病，但隨著馬立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)毒力持續進化并出現更具毒力的致病型，使現有的疫苗保護力不足[2-3]。MDV感染雞后會形成快速發病的淋巴瘤，導致雞群病死率顯著上升[4]，所以在研發MDV新型疫苗的基礎上，尋找有效的抗淋巴瘤藥物也是降低養殖場經濟損失和提高綜合防控能力的途徑。MDCC-MSB-1 細胞作為 MDV 誘導產生的淋巴瘤細胞系，當接種到易感雞中時還可以誘導腫瘤，是廣泛應用的抗 MD 腫瘤藥物研究模型[5]。

大蒜(Alliumsativum)中的烯丙基硫化合物具有預防和/或控制癌癥的生物效應，其中二烯丙基二硫化物(DADS)占大蒜油中脂溶性硫化物總量的40%～60%，具有更穩定的理化性質，且與水溶性烯丙基硫化物相比，脂溶性硫化物是一種更有效的抗腫瘤細胞增殖劑[6]。目前已有研究發現，DADS通過Bax觸發的線粒體途徑在人癌細胞中引起胱天蛋白酶依賴性細胞凋亡[7]，LU等[8]也發現DADS可以激活線粒體途徑誘導T24細胞凋亡。此外，據報道，DADS通過mTOR途徑誘導K562和NB4髓樣白血病細胞系的凋亡和自噬，Fas/FasL途徑的激活可能在DADS誘導的K562細胞凋亡中起重要作用[9-10]。

1 材料與方法

1.1 細胞、培養基及主要試劑MDCC-MSB-1細胞株購自哈爾濱獸醫研究所。DADS購自Alfa Aesar(純度為80%)。胎牛血清、RPMI 1640培養基、青霉素和鏈霉素、CCK-8溶液、吖啶橙、JC-1染色試劑盒(恩樾生物科技有限公司)。Aneexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物有限公司)。HRP標記山羊抗兔，Anti-P53 antibody(Servicebio)。cDNA反轉錄試劑盒、Q-PCR試劑盒(北京全式金生物技術有限公司)。其他試劑皆為國產分析純。

1.2 MDCC-MSB-1細胞培養在含10%胎牛血清、1%雙抗(100 U/mL青霉素和鏈霉素)和2 mmol/LL-谷氨酰胺的RPMI-1640完全培養液中，于37℃、5%CO2的飽和濕度細胞培養箱中培養，2～3 d傳代1次，1 000 r/min離心5 min得到細胞沉淀。

1.3 藥物準備與處理DADS和Tween-80以1∶2的比例配制成母液，母液的濃度為18 230 μmol/L，用0.9%無菌生理鹽水稀釋后-20℃保存備用。DADS作用于對數生長期的MDCC-MSB-1細胞，使藥物終濃度為0,50,100,150 μmol/L，培養24 h后收集細胞。

1.4 AO染色觀察細胞凋亡形態變化用RPMI1640培養基調整細胞濃度為6×105個/孔，接種于12孔板，DADS處理24 h后收集細胞，PBS洗滌，計數并調節細胞濃度至 106個/mL，取適量的細胞懸液，加入吖啶橙(acridine orange stain,AO)，使AO終質量濃度為 8.5～17.0 mg/L，輕輕混勻，室溫避光染色15～20 min，滴加于載玻片上并加蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡率DADS處理MDCC-MSB-1細胞24 h后，收集細胞，用PBS洗滌細胞2次，2 000 r/min離心5 min，500 μL 預冷的Binding Buffer懸浮細胞，加入13 μL Annexin V-FITC混勻后加入13 μL PI再次混勻，室溫避光反應15 min。2 h內用流式細胞儀進行檢測。

1.6 JC-1染色法檢測線粒體膜電位的變化取對數生長期的MDCC-MSB-1細胞，用RPMI1640培養基調整細胞濃度為3×106個/mL，接種于6孔板，設置陰性對照和陽性對照。陰性對照：收集細胞后直接重懸于JC-1染色緩沖液。陽性對照：用10 μmol/L CCCP處理細胞20 min后，離心收集細胞后加入JC-1染色工作液，顛倒數次混勻并在37℃孵育20 min，染色完成后4℃ 600×g離心4 min，收集細胞用JC-1染色緩沖液洗滌2次，最后重懸于JC-1染色緩沖液。

1.7 Western blot檢測P53蛋白表達用Bradford法進行蛋白定量，總蛋白經變性、電泳、轉膜后，將轉好的膜于室溫下搖床上用5%脫脂牛奶(0.5% TBST配制)封閉1 h。按比例稀釋一抗(P53兔抗)，4℃孵育過夜，二抗(山羊抗兔)用TBST稀釋3 000倍，室溫下孵育1 h。ECL顯影試劑溶液與膜充分反應1～2 min后開始曝光。將曝光膠片進行掃描存檔，PhotoShop整理去色，Alpha軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.8 Caspase-3和Caspase-9活性檢測用反應緩沖液梯度稀釋10 mmol/LpNA標準品，測定405 nm吸光度D值，以D值為橫軸，對應的pNA濃度為縱軸制作標準曲線。根據活性測定說明書設置反應體系，Caspase-3特異水解的多肽底物為DEVD-pNA，Caspase-9特異水解的多肽底物為IETD-pNA。蓋緊96孔板并用封口膜密封，在37℃培養箱中培養2 h，觀察肉眼可見顏色變黃時的D405值為0.2，此時可上酶標儀檢測，根據公式計算Caspase活性增加的百分比。Caspase活性增加的百分比= 樣品試驗組/對照組×100%。

1.9 Q-PCR檢測Caspase-3和Caspase-9 mRNA表達水平根據GenBank中雞β-actin(L08165)、Caspase-3(NM20475.1)和Caspase-9(AY057940.1)的基因序列，應用Primer 5軟件設計引物(表1)，引物由擎科生物有限公司合成。用TRIzol法提取總RNA，根據說明書逆轉錄成cDNA，反應體系為20 μL：1 μL cDNA，內參上、下引物各1 μL，10 μL 2×taq mix，剩下的用ddH2O補足。Q-PCR擴增條件：94℃ 30 s;94℃ 5 s，60℃ 30s，共30個循環。

表1 Caspase-3、Caspase-9以及內參引物序列

2 結果

2.1 DADS誘導MDCC-MSB-1細胞發生凋亡的形態觀察AO染色觀察DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后細胞的凋亡形態變化(圖1)。空白組細胞質均染呈綠色，胞漿豐富，細胞界限清晰，隨著DADS濃度的升高，細胞胞質內碎片增多，呈顆粒狀。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L

2.2 DADS誘導MDCC-MSB-1細胞凋亡加劇DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后對細胞凋亡的影響見圖2。隨著DADS濃度的升高，(annexin V-FITC)+/PI+區域和(annexin V-FITC)+/PI-區域的熒光信號越來越強，細胞凋亡率呈劑量依賴性增多。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L。A～D.流式細胞圖;E.柱狀圖。*示P<0.05, **示P<0.01。下同

2.3 DADS誘導MDCC-MSB-1細胞線粒體膜電位下降JC-1通過正常細胞(0 μmol/L)的線粒體膜極性進入線粒體內，并因濃度升高而形成發射紅色熒光的多聚體，主要集中在P2象限，隨著DADS濃度的升高，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內釋放，濃度降低，逆轉為發射綠色熒光的單體形式，從紅色向綠色進發(P2轉向P4象限)(圖3)。

A.0 μmol/L;B.50 μmol/L;C.100 μmol/L;D.150 μmol/L

2.4 DADS誘導MDCC-MSB-1細胞P53凋亡蛋白表達增多P53是重要的腫瘤抑制基因，參與細胞凋亡的進程。DADS在作用MDCC-MSB-1細胞24 h 后可誘導P53蛋白表達水平的增多(圖4)。

A.印跡圖；B.柱狀圖

2.5 DADS誘導細胞Caspase-3和Caspase-9活性增強DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后Caspase-3和Caspase-9的活性百分比呈極顯著性增高(P<0.01)(圖5)，Caspase-9上調幅度更大，可能是因為激活Caspase-9的上游調控因子更為廣泛，除線粒體凋亡途徑外可能還受到內質網應激等通路的影響。

圖5 DADS作用MDCC-MSB-1細胞24 h后Caspase-9、Caspase-3蛋白活性增加百分比變化

2.6 DADS上調細胞Caspase-3和Caspase-9 mRNA 表達水平所有3種濃度的DADS均誘導MDCC-MSB-1細胞中Caspase-3和Caspase-9 mRNA的相對表達增加，且Caspase-9 mRNA相對表達量的變化呈劑量依賴性(圖6)。

圖6 DADS誘導MDCC-MSB-1細胞Caspase-9(左)和Caspase-3(右)mRNA的相對表達量的變化

3 討論

MDV在長期的潛伏階段躲避了免疫系統的攻擊，入侵淋巴細胞后將其轉化為腫瘤細胞，引發免疫抑制和繼發性感染，導致雞群較高的發病率和病死率[11-12]。DADS作為廣泛的腫瘤抑制劑，對MD的治療還少見報道。我們前期的試驗發現，DADS可以誘導MDCC-MSB-1細胞活力的降低，并引起細胞周期阻滯(未發表結果)，同時也發現DADS具有抑制MDV在雞體內的復制作用[13]，說明DADS可能是抗馬立克病的候選藥物，有繼續研究的價值。

細胞凋亡是生物體內清除腫瘤細胞，遏制腫瘤形成和發展的重要機制。線粒體通過氧化磷酸化提供細胞所需的能量，細胞對線粒體的依賴也成為細胞的致命弱點，稱為細胞凋亡重要生物過程的主要調節點[14]，且線粒體在 MDV 誘導的細胞轉化和隨后的淋巴瘤形成(如雞的 MD 發育)中不可或缺[15]。p53 是重要的腫瘤抑制基因，能調控細胞凋亡和細胞周期，有研究發現 MDV 編碼的主要致瘤因子 meq 蛋白通過與宿主細胞中 p53 和 p21 蛋白相互作用來影響致瘤過程[16]，Meq 的外源表達能抑制 p53 介導的轉錄活性和細胞凋亡[17]，所以增強 p53 誘導腫瘤細胞凋亡的能力顯得尤其重要。在凋亡細胞中，被激活的 p53 會快速移位到線粒體外膜并與膜上的 Bcl2 家族成員結合，增加膜的通透性，使線粒體內的促凋亡蛋白(細胞色素 c)釋放進入胞漿，激活 Caspase 家族啟動序列性酶解死亡程序導致 DNA 降解[18]。本試驗在DADS 處理的 MDCC-MSB-1 細胞中也檢測到 p53 蛋白的表達增多，線粒體膜電位的喪失，以及 Caspase-9 和 Caspase-3 基因的轉錄水平和蛋白活性的上調。因此，推測 DADS 通過 p53 介導的線粒體內源性凋亡途徑來促進 MDCC-MSB-1 細胞的凋亡，但是否同時存在別的凋亡通路還需進一步證實。