制痂酊對大鼠深Ⅱ度燒傷的創傷修復及作用機制

李飛龍，黃趙剛，程 鋼,高金平，詹迪迪，李 俊，夏 泉

(1.安徽醫科大學第一附屬醫院藥劑科、國家中醫藥管理局中藥化學三級實驗室，2.安徽醫科大學藥學院，3.安徽醫科大學第一附屬醫院皮膚科、安徽醫科大學皮膚病研究所，安徽 合肥 230032；4.安徽省兒童醫院藥劑科,安徽 合肥 230051)

燒傷是常見的創傷類疾病，處于外傷疾病第四位，全球每年有大量的人因燒傷而死亡。燒燙傷具有較高的致殘、致死率，危害程度高，給人類社會造成重大的負擔[1-2]。制痂酊為我院特色制劑(皖藥制字Z20050013)，由黃柏、黃芩、兒茶、冰片采用滲漉的方法制備而成。其主要成分為黃芩苷、兒茶素和小檗堿，具有抑菌、減少炎癥反應、收斂、促進創面愈合和結痂等作用，廣泛應用于燒傷、褥瘡及皮膚擦傷的治療等，臨床療效確切[3-4]。前期研究對制痂酊主要成份黃芩苷、小檗堿的含量做了嚴格的質量控制，保證了制劑安全有效[5]。本研究采用大鼠深Ⅱ度燒傷模型，觀察制痂酊對燒傷后大鼠的創面修護作用和對血清炎癥介質的影響，探討其可能的作用機制，為制痂酊的使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 普通級SD大鼠100只，雌雄各半，體質量(200-250)g。由安徽醫科大學動物中心提供，許可證號SCXK(皖)2017-001。

1.1.2藥品與試劑 制痂酊(安徽醫科大學第一附屬醫院制劑，皖藥制字Z20050013：批號190619)；濕潤燒傷膏(汕頭市美寶制藥有限公司，國藥準字Z20000004)；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1B)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(北京博奧森生物技術有限公司)。

1.1.3儀器與設備 Zokia HC-3018R高速冷凍離心機(安徽中科中佳科學儀器公司); AB135-5電子天平(上海梅特勒)；YXQ-LS-100II高壓滅菌鍋(上海博迅實業有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫療器械五廠)；多功能酶標儀(美國Tecan公司)；臺式控溫燙傷儀(振華儀器有限公司)；SB3200超聲波清洗器(必能信超聲儀器公司)。

1.2 方法

1.2.1動物分組與模型制備 大鼠飼養7 d，隨機分為正常組、模型組、陽性對照組(濕潤燒傷膏)、制痂酊高劑量組(含黃芩苷:5.92 g·L-1、鹽酸小檗堿:3.28 g·L-1、兒茶素：42.62 g·L-1)，制痂酊低劑量組(含黃芩苷:2.96 g·L-1、鹽鹽酸小檗堿:1.64 g·L-1、兒茶素：21.31 g·L-1)，各組20只。除正常組外，其余各組制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型[6]：大鼠禁水禁食12 h，剃除背部毛發后，用10%的硫化鈉溶液脫毛，腹腔注射10%水合氯醛溶液(3.5 mL·kg-1)麻醉，乳酸鈉林格抗休克，大鼠均未出現休克。病理證實為深Ⅱ度燒傷：燒傷部位局部表皮消失，部分真皮層內細胞壞死，皮下組織血管擴張水腫，可見急慢性炎細胞浸潤，為深Ⅱ度燙傷。

1.2.2創面處理及給藥方法 大鼠燙傷30 min后，陽性對照組給予濕潤燒傷膏、制痂酊高、低劑量組創面分別高劑量制痂酊、低劑量制痂酊，每天換藥2次，每次換藥前無菌生理鹽水清洗，正常組與模型組只用無菌生理鹽水清洗。為防止大鼠舔舐傷口，在其頭頸部套一硬殼項圈。單籠飼養，自由進食飲水。

1.2.3創面愈合率 每組各取5只大鼠，計算3 d，7 d，14 d的創面愈合率。通過標記稱質量法計算創面愈合率：造模2 d后作為燒傷面積，大鼠創面鋪上方格透明紙，邊緣處描繪作為記號，方格紙剪下稱質量代替創面面積，創面愈合率/%=(燒傷面積-創面面積)/燒傷面積×100%。

1.2.4創面組織含水量測定 每組各取5只大鼠，計算3 、7、14 d的創面組織含水量。大鼠麻醉后頸椎脫臼處死，切下創面完整皮膚組織約200 mg，清凈后稱質量(W1)，烤箱烘干(80 ℃，24 h)稱質量(W2)。利用組織烘干前后水分前后減少的方法計算組織含水量：創面含水量/%=(W1-W2)/W1×100%。

1.2.5深Ⅱ度燒傷大鼠創面組織SOD 、CAT含量和MDA活性的測定 燙傷7 d取大鼠8只，麻醉處死后，切下創面完整皮膚組織在冰上破碎，用10%的冷生理鹽水研磨成漿，4 ℃離心(3 000 r·min-1，10 min)，按照試劑盒操作方法，測定各組大鼠創面組織SOD、CAT活性和MDA含量。

1.2.6深Ⅱ度燒傷大鼠血清制備及TNF-α、IL-1β、IL-6水平測定 大鼠麻醉后，股動脈取血，離心取上清(3 500 r·min-1，10 min)，ELISA法檢測燙傷后 7 d各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，步驟按試劑盒說明書操作。

1.3 統計學處理實驗數據以表示，SPSS 22.0進行單因素方差分析，組間差異采用LSD法。

2 結果

2.1 制痂酊對深Ⅱ度燒傷大鼠創面愈合率的影響燒傷后d 3各組大鼠創面愈合率無差異；d 7創面愈合率明顯升高，與模型組相比，陽性對照組、高劑量、低劑量制痂酊組差異均有顯著性(P< 0.05)；d 14各組與模型組相比差異有統計學意義(P<0.05)，制痂酊高劑量組與陽性藥組相比差異有統計學意義(P<0.05)。表明制痂酊能促進創面的愈合，愈合效果和時間劑量呈一定的關系，創面愈合效果隨著用藥時間延長呈上升趨勢。見Tab 1。

Tab 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound healing rate of deep partial thickness burn

2.2 制痂酊對深Ⅱ度燒傷大鼠創面含水量的影響深Ⅱ度燒傷大鼠各組創面含水量比正常組明顯升高(P<0.05)。陽性對照組、制痂酊高低劑量組，創面含水量d 1就有所降低，隨著用藥持續，含水量在燙傷各時間點逐漸下降，但仍高于正常組。陽性對照組，制痂酊高、低劑量組創面含水量在d 7、14顯著下降，與模型組相比差異有顯著性(P<0.05)。制痂酊高、低劑量與陽性對照組無差異(P>0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effect of Medicoscab Tincture on wound water content of deep partial thickness burn

2.3 制痂酊對深Ⅱ度燒傷大鼠對創面組織SOD、CAT含量和MDA活性的影響深Ⅱ度燒傷大鼠7 d，與正常組相比，各組大鼠創面組織SOD、CAT活性明顯降低，MDA含量升高(P<0.01)；與模型組相比，陽性對照組，制痂酊高、低劑量組SOD明顯升高、MDA下降(P<0.01)，CAT差異無顯著性(P>0.05)。說明制痂酊能顯著升高燒傷大鼠SOD的活性而下調MDA的含量，見Fig 1。

Fig 1 Effect of Medicoscab Tincture on wound SOD, CAT, MDA of deep partial thickness burn rats

2.4 制痂酊對深Ⅱ度燒傷大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平的影響深Ⅱ度燒傷大鼠7 d，模型組

血清TNF-α、IL-1β、IL-6較正常組升高(P<0.01)。制痂酊高、低劑量組，陽性對照組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6明顯低于模型組(P<0.01),見Fig 2。

Fig 2 Effect of Medicoscab Tincture on serum TNA-α, IL-1β, IL-6 of deep partial-thickness burn

3 討論

制痂酊是由黃柏、黃芩、兒茶、冰片組成的特色中藥復方制劑，臨床主要用于燙傷(Ⅱ度燒傷及以下)、外傷，具有收斂消炎、抗菌、結痂等作用。燒傷創面處理非常重要，燒傷患者的生存質量與創面治療的效果密切相關[7]。若創面處理不當，會增加治療難度，引起創面加深甚至感染影響預后。制痂酊主要成分黃柏、黃芩具有清熱解毒、瀉火燥濕；兒茶能協助在創面形成一層膜，有收斂和防治細菌的感染的作用；冰片清涼開竅，以乙醇為溶媒可增強穿透力和殺菌作用。本研究顯示制痂酊能在一定程度促進燒傷大鼠皮膚的愈合，縮短燒傷創面的愈合時間，對燒傷創面起到一定的保護作用。

皮膚燒傷后，燒傷組織會因炎癥反應產生大量的炎性滲出。滲出液能夠一定程度的稀釋毒素和致炎因子，減輕毒素對局部損害，其所含補體和抗體可消滅病原體或滅活毒素。但滲出物主要成分是水，組織含水過多會引起組織水腫而缺血缺氧，造成進一步損傷，創面難以恢復。因此含水量能間接反映創面的恢復情況。本研究顯示，制痂酊能減少燙傷后7 d、14 d大鼠創面組織中含水量，減少水腫，改善燒傷創面，防止進一步惡化。

皮膚燒傷后由于組織水腫而處于缺氧狀態，能量代謝發生障礙，細胞產生氧化應激產生大量的氧自由基(reactive oxygen species，ROS)。ROS可引起過氧化反應，損害細胞膜的結構和功能，也可以破壞血管引起滲出增加，進一步加重損傷。細胞損傷也會促進多種炎癥因子如TNF-α、IL-1等釋放，加重炎癥損傷延緩創傷愈合[8]。天然活性的抗氧化肽AOP1可減輕燙傷引起的氧化應激，促進小鼠皮膚燙傷創面的愈合修復[9]；通過藥物抑制氧化應激反應能夠降低燒傷大鼠心肌、肺、腎臟組織并發癥損傷[10]。SOD是生物體內一種抗氧化金屬酶，它能夠催化超氧陰離子自由基歧化生成O2-和H2O2，在機體參與抗氧化、清除氧自由基中發揮重要作用。在過氧化氫酶(CAT)作用下H2O2分解為分子氧和水，SOD和CAT可以減少氧化應激，增強，燒傷大鼠創面的抗氧化能力，加快燒傷創面的恢復。膜脂質過氧化產物丙二醛(MDA)會破壞蛋白質和核酸等大分子，加劇膜的損傷。所以測量組織中SOD、CAT及MDA能夠反映脂質過氧化，間接反映細胞損傷程度。實驗發現，制痂酊能明顯升高燒傷大鼠創面組織SOD的活性，下調MDA的含量，制痂酊促進燒傷創面愈合可能與此機制有關。

皮膚燒傷后，體內環境會發生一系列調控，表現為多種細胞炎癥介質和生長因子之間相互協作。炎癥反應與創面的修復有著密切的關系，炎癥程度的大小能夠反應燒傷創面的修復情況，過度炎癥反應不利于燒傷創面的修復，甚至引起壞死[11]。炎癥反應關鍵分子TNF-α、IL-1β，IL-6在炎癥反應過程中起著重要作用。TNF-α可活化各種免疫細胞如中細粒細胞引起級聯反應，誘導其他炎性細胞因子如IL-1β、IL-6等的產生，以致發生全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)甚至多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)[12]。因此，盡早減少燒傷早期創面炎癥因子的釋放，可以促進燒傷的創面愈合、減少全身反應。本研究結果顯示，在燒傷7 d后制痂酊能明顯降低大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量，從而減輕炎癥反應，有利于創面愈合。

綜上所述，制痂酊可以提高大鼠深Ⅱ度燒傷創面愈合率，降低創面組織含水量，其可能與制痂酊能升高燒傷大鼠創面組織SOD的活性，下調MDA的含量，降低燙傷大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量有關。關于制痂酊治療燒傷具體分子機制和信號通路還需進一步研究。