丹參酮ⅡA通過調控Grp78/caspase-12通路改善小鼠內質網應激性肝損傷

李曉明，常 偉，劉 浩

(蚌埠醫學院藥學院，安徽 蚌埠 233030)

急性肝損傷是所有肝臟疾病共有的病理過程，其病因較為復雜[1]。大量研究發現，外源性物質誘發的肝細胞內質網應激與多種肝病的發生關系密切，也是急性肝損傷發生的新的機制[2]。本課題組前期利用衣霉素成功構建了內質網應激性急性肝損傷小鼠模型，為急性肝損傷機制研究提供了新的模型，但相關治療藥物仍缺乏研究[3]。丹參酮是一種臨床常用的抗炎消菌藥，其主要含有丹參酮Ⅱ A、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ等活性成分[4]。許多基礎和臨床研究表明，丹參酮多種活性成分對急性肝損傷均具有一定的預防和治療作用，如丹參酮Ⅱ A對利福平(rifampicin，RIF)、雷公藤甲素(triptolide, TP)、4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal，4-HNE)等藥物誘導的多種急性肝損傷模型均具有較好的肝保護作用[5-9]。同時也有研究發現，丹參酮Ⅱ A對缺血/再灌注性肝損傷以及α-萘異硫氰酸酯(α-naphthyl isothiocyanate，ANIT)誘導的肝內膽汁淤積性肝損傷保護作用較好[10-11]，但對衣霉素誘導的內質網應激性急性肝損傷的作用尚未見報道。為此，本研究通過建立衣霉素誘導的小鼠內質網應激性急性肝損傷模型，考察丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導小鼠急性肝損傷的保護作用及其部分機制，為臨床合理使用丹參酮Ⅱ A提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 化學試劑衣霉素，購自美國Sigma公司，純度98%，每瓶10 mg，批號：654380-10MG；丹參酮Ⅱ A購自上海純優生物科技有限公司，純度≥98%，每瓶10 mg，批號：568-72-9-10MG；聯苯雙酯滴丸(bifendate, Bif)購自萬邦德制藥集團股份有限公司，每丸含聯苯雙酯1.5 mg，批號：A02J180112。丙氨酸氨基轉移酶(ALT，批號：mI058577)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST，批號：mI016824)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：mI643059)、丙二醛(MDA，批號：mI016824)等ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。葡萄糖調節蛋白78抗體(glucose regulated protein 78 ku，Grp78，鼠抗兔單克隆抗體，貨號：AF5366)購自江蘇Affinity Biosciences(LTD)公司；門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12抗體(cysteine aspartic acid specific protease-12，caspase-12，鼠抗兔單克隆抗體，貨號：55238-1-AP)、caspase-3抗體(鼠抗兔單克隆抗體，貨號：19677-1-AP)等抗體均購自美國Proteintech公司；B淋巴細胞瘤-2基因抗體(B-cell lymphoma 2，Bcl-2，鼠抗兔單克隆抗體，貨號：3498S)、Bcl-2相關X蛋白抗體(Bcl-2-associated X protein，Bax，鼠抗兔單克隆抗體，貨號：2774S)等抗體均購自美國cell signaling technology(CST)公司；Grp78和caspase-12引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；TUNEL凋亡檢測試劑盒(顯色法，貨號：QIA33)購自美國Merck公司；實時定量PCR試劑盒購自貝克曼庫爾特商貿(中國)有限公司。

1.2 主要儀器IX-73熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；倒置顯微鏡圖像采集系統(日本Olympus公司)；X1R低溫高速離心機(美國賽默斯世爾公司)；MILLI-Q型純水機(武漢優普純水設備有限公司)；DYY-6C型電泳儀(北京六一)；酶標儀(美國BioTke公司)； Mini-Protena電泳系統(美國伯樂公司)；CKX41-A32PH倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；凝膠成像系統(美國biorad公司)。

1.3 動物SPF級昆明種小鼠，♂，(18-22) g，5-6 周，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，合格證號：SCXK(魯)2019-0003。適應性飼養3 d，自由飲食飲水，維持光照和黑暗各12 h，溫度20 ℃-25 ℃，相對濕度(50±5)%。本研究經蚌埠醫學院實驗動物中心和倫理委員會批準。

1.4 動物分組及造模將60只小鼠，隨機分為6組：正常組、模型組、陽性藥組(Bif，150 mg·kg-1)、丹參酮Ⅱ A低劑量組(10 mg·kg-1)、中劑量組(20 mg·kg-1)、高劑量組(40 mg·kg-1)，每組10只。用藥組小鼠按0.1 ml/10 g分別灌胃給予相應劑量丹參酮Ⅱ A或聯苯雙酯，正常組和模型組同法給予等量生理鹽水，1次/d，連續7 d。所有小鼠在末次給藥后禁食10 h，除正常組外，其余小鼠均單次灌胃給予衣霉素(1 mg·kg-1)進行造模[3]，再禁食12 h。稱體質量，眼眶靜脈叢采血，靜置30 min后，離心(4 ℃，3 000 r·min-1×20 min)，保留上清用于AST、ALT等生化指標檢測；頸椎脫臼處死小鼠，取肝臟、脾臟、胸腺稱質量，計算內臟指數 [內臟指數=肝臟/脾臟/胸腺質量/小鼠體質量]，剪取肝臟相同部位制備組織勻漿和蛋白上樣樣品分別用于MDA、SOD含量以及Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax、Bcl-2等蛋白水平測定，剩余肝臟置于10%甲醛中固定保存，用于組織病理學、TUNEL染色和免疫組化檢測。

1.5 小鼠血清ALT、AST和肝組織SOD、MDA檢測嚴格按試劑盒說明書的操作，采用賴氏法測定血清ALT、AST活性和肝組織勻漿(按組織塊：生理鹽水=1 ∶9加入到勻漿器中，在冰上研磨，制備成10%肝勻漿)中SOD、MDA水平。

1.6 小鼠肝組織病理形態學檢查取肝左葉組織，10%甲醛固定，經乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、5 μm連續切片、常規HE染色、中性樹脂封片后，光學顯微鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.7 小鼠肝組織免疫組化取肝左葉組織，10%甲醛固定，石蠟包埋、4 μm連續切片，60 ℃溫箱烘干，用抗原修復液(檸檬酸緩沖液)修復15 min，3% H2O2室溫避光孵育15 min，再分別加入抗 Grp78 抗體(1 ∶200)、抗 caspase-12 抗體(1 ∶200) 4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，加入SABC 室溫反應 30 min，DAB 顯色，蘇木精復染，封片，顯微鏡下觀察并拍片。

1.8 小鼠肝組織TUNEL染色充分脫蠟和水化，利用蛋白酶 k進行細胞通透10-30 min，加入TUNEL 反應液37 ℃反應1 h，加入DAB反應10 min，PBS 的充分清洗 5次，封片，顯微鏡下觀察并拍片。

1.9 Western blot檢測每組隨機取6塊肝組織測定相關蛋白的表達量。剪取50 mg左右肝組織到2 mL玻璃勻漿器內，同時加入1 mL 蛋白裂解液，于冰上勻漿 5 min 至肉眼看不見纖維，冰上裂解30 min，轉移入預冷的1.5 mL Ep 管中，4 ℃，12 000×g離心 20 min，取上清，用BCA法測定蛋白質濃度，加入上樣緩沖液。取20 μg樣品蛋白經 SDS-PAGE 轉移電泳、抗體免疫、ECL 顯影、曝光等步驟檢測Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax、Bcl-2 蛋白表達情況(GADPH 做內參)。

1.10 實時定量 PCR(RT-PCR)RT-PCR 檢測肝組織中Grp78、caspase-12 mRNA 表達變化，提取肝臟組織總RNA，反轉錄成 cDNA，以 cDNA 為模板進行擴增，檢測 mRNA 表達量。引物序列如下：GRP78 正義鏈5′-ATGATGAAGTTCACTGTGGTGG-3′，反義鏈 5′-CTGATCGTTGGCTATGATCTCC-3′。caspase-12正義鏈5′-TGGCCCATGAATCACATCTAAT-3′ ，反義鏈5′-TGGACAAAGCTTCAGTGTATCT-3′。

2 結果

2.1 丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST和肝組織勻漿SOD、MDA的影響與正常組相比，模型組小鼠血清ALT、AST和肝組織勻漿MDA活性明顯升高，SOD水平明顯下降。與模型組相比，丹參酮Ⅱ A(20、40 mg·kg-1)和Bif(150 mg·kg-1)均能明顯降低小鼠ALT、AST和MDA活性、升高SOD水平，差異有顯著性(均P<0.05或P<0.01)，見Tab 1。

Tab 1 Effect of tanshinone ⅡA on ALT, AST, SOD and MDA in tunicamycin-induced mice n=10)

2.2 丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的急性肝損傷小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數的影響與正常組相比，衣霉素模型組小鼠的肝、脾及胸腺指數均明顯升高。與模型組相比，丹參酮Ⅱ A不同劑量和Bif均能明顯降低衣霉素升高的小鼠肝、脾及胸腺指數，見Tab 2。

Tab 2 Effect of tanshinone ⅡA on liver, spleen, thymus index in liver of tunicamycin-induced mice n=10)

2.3 丹參酮Ⅱ A對急性肝損傷小鼠肝臟病理損傷和肝細胞凋亡的影響正常小鼠肝組織中肝小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周整齊排列(Fig 1A)，肝組織細胞凋亡較少(Fig 1B)，而灌胃衣霉素后小鼠肝小葉結構發生異常，細胞索結構紊亂，間質間可見較明顯的炎細胞浸潤和大量肝細胞凋亡。丹參酮Ⅱ A(10、20、40 mg·kg-1)和Bif(150 mg·kg-1)均能明顯減輕衣霉素誘導的炎細胞浸潤、細胞索紊亂和肝細胞凋亡(Fig 1)。

2.4 免疫組化和RT-PCR結果鏡下可見陽性染色的細胞呈棕褐色，正常組小鼠肝組織內Grp78(Fig 2A)和caspase-12(Fig 2B) 蛋白和mRNA均表達較少，誘發急性肝損傷后，肝組織內 Grp78和caspase-12的蛋白和mRNA表達明顯增多，且主要位于受損肝組織部位。丹參酮Ⅱ A干預后肝組織內Grp78和caspase-12蛋白和mRNA表達明顯減少(Tab 3,Fig 2)。

Fig 1 Effect of tanshinone ⅡA on pathological changes of liver of tunicamycin-treated mice (scale bar=50 μm)

Tab 3 Level of Grp78, caspase-12 mRNA in liver of tunicamycin-treated mice n=10)

2.5 Western blot結果與正常組相比，模型組Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax表達明顯增加，Bcl-2明顯減少。丹參酮Ⅱ A干預后肝組織內Grp78、caspase-12、caspase-3、Bax表達水平明顯減少，Bcl-2明顯增加(Fig 3A, 3B)。

Fig 2 Effect of tanshinone ⅡA on Grp78 and caspase-12 protein expression in liver of tunicamycin-treated mice (scale bar=50 μm)

Fig 3 Effect of tanshinone ⅡA on Grp78, caspase-9, caspase-3, Bax and Bcl-2 protein levels in liver of tunicamycin-treated mice

3 討論

內質網(endoplasmic reticulum，ER)是真核細胞蛋白質合成、鈣離子貯存以及脂質生成的主要場所，是維持細胞正常功能的重要細胞器，當細胞穩態改變時會干擾內質網功能而引起內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[12]。ERS是真核細胞的一種自我保護機制，在ERS早期階段細胞可對抗不良刺激，恢復內質網穩態，發揮自我保護作用，但是ERS反應時間過長或過強時，會激活ERS特異性凋亡程序，以清除受損細胞[12]。衣霉素是一種常用的ERS誘導劑，可通過抑制內質網糖基化，過度激活ERS，介導細胞調亡。已有許多研究報道了使用衣霉素建立小鼠、大鼠、胃癌細胞、成骨細胞、神經細胞、脂肪細胞等ERS體內和體外模型[2,14-15]，如衣霉素體外刺激小鼠成骨細胞MC3T3-E1誘導ERS[16]。最近也有研究發現，采用衣霉素體內給藥還可激活肝細胞ERS導致肝臟損傷和肝細胞調亡，但相關報道較少，仍有待進一步驗證。

為進一步考察衣霉素誘導ERS小鼠肝損傷的效果和機制，本研究采用衣霉素1 mg·kg-1單次灌胃給藥24 h，誘導小鼠ERS急性肝損傷模型。HE染色結果顯示，模型組小鼠肝組織細胞明顯腫脹，肝小葉界限模糊，并存在少量炎細胞浸潤和肝細胞壞死；同時模型組小鼠肝指數、脾指數及胸腺指數均明顯增加，血清中AST、ALT水平和肝組織勻漿中MDA活性明顯升高、SOD活性明顯下降，以上結果提示造模小鼠已發生肝損傷。葡萄糖調節蛋白78(glucose regulated protein 78kD，Grp78)，又名免疫球蛋白重鏈結合蛋白(immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip)是ERS發生的重要標志物，Grp78/Bip水平可直接反映細胞的ERS水平，本研究結果顯示，模型組小鼠肝組織中Grp78/Bip蛋白表達明顯增加，表明衣霉素成功激活了小鼠肝細胞ERS反應。門冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶12(cysteine aspartic acid specific protease-12，caspase-12)是內質網特異性的凋亡效應蛋白，其可通過切割Bid 蛋白，促使活性的 p15 Bid 蛋白釋放和堆積，激活凋亡執行因子caspase-3，從而抑制或活化 Bax、Bcl-2等凋亡相關蛋白的表達，誘導細胞凋亡[17]。本研究Western blot結果顯示，模型組小鼠肝組織中caspase-12、caspase-3及Bax表達明顯升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯下降，表明衣霉素可能是通過過度激活ERS觸發 Grp78/caspase-12 信號通路誘導了肝細胞的凋亡。因此，通過阻斷ERS觸發 Grp78/caspase-12 信號通路的活化可能是防治肝損傷的全新思路。

丹參酮是從中藥丹參中提取的脂溶性菲醌化合物。大量研究發現，丹參酮Ⅱ A具有抗微生物、抗炎、抗腫瘤、降血糖等多種藥理作用[18]。許多研究證實，丹參酮Ⅱ A可通過調節PPARα、Nrf2/ARE、MEK/ERK/mTOR 等通路有效改善急性肝損傷小鼠的病理損傷[3-5]，但丹參酮Ⅱ A能否通過通路調控ERS觸發的caspase-12/caspase-3信號通路而發揮抗肝損傷的作用，尚未見報道。本研究將聯苯雙酯和不同濃度丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的ERS小鼠進行預先給藥后發現，與模型組相比，聯苯雙酯和丹參酮Ⅱ A均能明顯減輕衣霉素誘導的炎細胞浸潤、細胞索紊亂和肝細胞凋亡，降低小鼠血清中 AST、ALT水平，升高肝組織中SOD含量，而減少 MDA 含量，提示丹參酮Ⅱ A對衣霉素誘導的小鼠急性肝損傷具有較好的保護作用。同時Western blot結果顯示，與模型組相比，丹參酮Ⅱ A治療組小鼠肝組織中Grp78/Bip、caspase-12、caspase-3及Bax表達明顯下降，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達明顯升高，表明丹參酮Ⅱ A可能是通過下調 Grp78/Bip 蛋白表達，拮抗ERS 觸發 Grp78/caspase-12 通路的激活，發揮其抗凋亡的作用。

綜上表明，丹參酮Ⅱ A對衣霉素引起的損傷肝細胞具有一定的保護作用，其機制可能與其抑制 ERS 觸發的 Grp78/caspase-12 信號通路活化有關。本文為解釋急性肝損傷的發病機制提供了新的思路，也進一步驗證了丹參酮Ⅱ A對急性肝損傷的治療作用。此外，抑制Grp78/caspase-12 通路激活也有望成為臨床治療急性肝損傷的新策略及藥物研發的新思路。