基于網絡藥理學研究人參防治創傷性應激障礙藥效成分及作用靶點

王中立，干麗君，劉秀秀，李秀麗，易本誼

(九江學院護理學院，江西 九江 332000)

創傷性應激障礙(post-traumatic stress disorder，PTSD)指經歷超出承受能力的應激事件后，出現以對相似應激敏感性增高、睡夢回顧應激事件和焦慮為主要臨床表現的神經精神疾病。由于社會生活模式轉變，生活工作壓力增加，應激事件暴露機率增高，同時醫療系統對神經精神疾病的重視及診斷標準的進步，臨床上PTSD的發病人數逐年增多[1]。據世界衛生組織統計，全球10%的人口經歷過足以導致PTSD發病的應激事件，其中60%的應激事件經歷者最終發展成為PTSD患者，一旦發病預后極差[2]。

PTSD的治療目前臨床主要采用心理疏導聯合藥物治療的方式，而臨床療效不能令人滿意，尤其在藥物治療領域。目前，治療PTSD的藥物中僅5-羥色胺再攝取抑制藥物被美國食品藥品監督管理局認可，然而通過大數據分析得到療效不確切的結論[3]。因此，尋找治療PTSD的有效藥物成為醫藥工作者一項重要的研究任務。

中醫學雖未有“創傷性應激障礙”之病名，根據其臨床特征可將其歸屬于情志病范疇。中醫藥治療情志病具有自身的特點和優勢。臨床前研究通過對治療情志病常用中藥進行篩選實驗發現了補氣類中藥防治PTSD的有效性，其中代表藥物為人參[4]。為了進一步深入研究人參發揮藥理作用的機制，從而更好的應用于臨床治療當中，本文應用網絡藥理學方法對人參有效成分、作用靶點以及可調控的病理生理過程進行研究分析，為實證人參防治PTSD的研究提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 數據資料人參成分數據來源于TCMSP數據分析平臺(http://tcmspw.com/index.php)，并根據中藥藥理學研究規范篩選潛在的有效成分作為研究對象[5]。篩選主要通過生物利用度和類藥性兩個指標進行，從而確定本研究的藥用成分(具體見研究結果1)。根據藥物成分獲得藥物的作用靶點信息，該數據同樣來源于TCMSP平臺。創傷性應激障礙相關基因數據來源于Gene Card(https://www.genecards.org/)和OMIM(https://omim.org/)數據庫。將兩數據庫結果綜合去重后獲得疾病相關基因。

1.2 研究方法分析獲得人參有效成分中最有利于作為藥物應用的有效成分，篩選條件為生物利用度≥30%，類藥性≥0.18。根據所篩選有效成分于數據庫中下載相應作用位點。藥物作用位點與疾病相關基因做交集獲得藥物治療疾病潛在的作用靶點。分別對藥物治療疾病的作用靶點進行網絡互作分析(PPI)、基因本體論富集分析(GO)和信號通路富集分析(KEGG)，從而獲得潛在作用靶點中的核心靶點(對于功能的影響權重最大，處于PPI網絡中心)，了解靶點基因的主要生物學功能以及通過什么途徑發揮具體的生物學作用。

1.3 統計學處理基因注釋、分類及取交集應用Perl計算機語言完成。藥物成分-疾病相關基因網絡圖應用cytoscape軟件完成。蛋白質互作網絡研究通過STRING(https://string-db.org/)。基因本體論富集分析、信號通路富集分析應用R計算機語言完成。

2 結果

2.1 人參有效成分、作用靶點及疾病相關基因檢索根據研究方法中的篩選規則對人參有效成分進行收集整理，數據來源TCMSP平臺，具體納入研究成分見Tab 1。藥物作用靶點及PTSD發病相關基因的具體內容由數據庫平臺提供。

Tab 1 Overview of bioavailability and medicinal propertiesof ginseng components included in study

2.2 人參防治PTSD作用靶點預測人參藥用成分作用位點與PTSD發病相關基因做交集獲得人參防治PTSD作用靶點。共得到16個相交的基因，如Fig 2,分別是ADRB2、NR3C2、SLC6A2、SLC6A3、MAOB、MAOA、SLC6A4、OPRM1、PRKCA、HTR3A、NOS2、ACHE、HMOX1、IL1B、IFNG、ADCYAP1。

Fig 1 Network pharmacological analysis of targets of ginseng inprevention and treatment of traumatic stress disorder

Fig 2 Venn map of ginseng target for preventing PTSD

2.3 人參作用靶點與PTSD相關基因網絡關系通過藥物靶點與疾病相關基因的相交所獲得的信息，反向得到人參防治PTSD的有效成分，即藥物成分的作用位點與疾病相關基因相重合，這樣就形成了藥物成分-成分靶點-疾病基因的網絡調控信息。根據研究方法中的預設條件共得到11種人參的藥用成分與PTSD發病密切相關的16個基因(見結果2.2)具有藥物靶點相互作用關系。11種人參藥用成分包括高麗槐素、吉九里香堿、人參皂苷Rh4、人參皂苷Rh2、灌木遠志酮A、鄰苯二甲酸二異辛酯、脫氧三尖杉酯堿、β-谷甾醇、阿樸天仙子堿、豆甾醇和山奈酚。

2.4 人參藥物成分防治PTSD作用靶點相互作用分析根據人參防治PTSD靶點基因獲得所對應的編碼蛋白，應用String軟件進行蛋白質相互作用分析，得到靶點蛋白之間的相互關系，同時分析獲得核心基因即網絡最中心的蛋白質(與其他蛋白質作用最廣泛，node值最大)，見Fig 3。

Fig 3 Results of PPI network analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.5 人參藥物成分防治PTSD作用靶點基因本體論富集分析應用GO富集分析的方法探討人參防治PTSD靶點基因在生理功能的富集情況，具有顯著統計學意義的前10位GO功能如Tab 2和Fig 4。結果顯示：靶點基因主要富集在離子通道和神經遞質兩大功能上。

Tab 2 Enrichment analysis of target genes ofginseng for prevention and treatment of PTSD

Fig 4 Results of GO enrichment analysis of targetsof ginseng in prevention and treatment of PTSD

2.6 人參藥物成分防治PTSD作用靶點基因信號通路富集分析應用KEGG信號通路富集分析的方法探討人參防治PTSD靶點基因富集在那些信號通路上發揮作用，具有顯著統計學意義的前10位KEGG信號通路如Tab 3和Fig 5。結果顯示：靶點基因主要富集在單胺類神經遞質和突觸囊泡轉運相關的信號通路上。

Fig 5 Results of KEGG enrichment analysis oftargets of ginseng in prevention and treatment of PTSD

Tab 3 Enrichment analysis of KEGG pathway ofginseng target for prevention and treatment of PTSD

3 討論

隨著大數據時代的到來，生物信息學被運用于生物醫學研究領域中是一個必然的趨勢，體現在中藥的研究中就是網絡藥理學。本研究應用網絡藥理學對人參防治PTSD的藥物有效成分及靶點進行了研究。研究結果顯示，人參所包含的11種有效成分分別作用于16個與PTSD發病密切相關的靶點基因，具有潛在的預防和治療PTSD的作用。進一步對16個靶點基因進行生物功能(GO)和信號通路(KEGG)分析，了解到人參通過調節5-羥色胺能突觸、兒茶酚胺能突觸和突觸小泡轉運功能等途徑發揮防治PTSD的藥理學作用。其中最為關鍵的基因通過蛋白質互作網絡(PPI)被發現，分別是5-羥色胺受體3A、單胺氧化酶A、腎上腺受體β2受體處于PPI網絡核心部位，可以作為重要靶點基因進行驗證研究。從人參有效藥用成分角度出發，研究結果顯示：人參有效成分中β-谷甾醇(beta-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、山奈酚(kaempferol)、阿樸天仙子堿(aposiopolamine)對神經遞質(包括5-羥色胺和單胺類神經遞質)的轉運、中樞神經系統內水平及相對應的受體具有調節作用。而吉九里香堿(girinimbin)、鄰苯二甲酸二異辛酯(diop)和灌木遠志酮 A(frutinone A)在PTSD的防治過程中主要通過作用于β2腎上腺素能受體發揮作用。因此，人參可以通過調控單胺類神經遞質代謝，改變相關受體活性發揮防治PTSD的藥理學作用。

關于人參預防和治療神經精神疾病的臨床前研究近年來被廣泛報道，其中也包括人參防治PTSD的文獻報道[6-8]。本課題組前期工作在C57BL/6N小鼠上發現人參水煎液可以逆轉由高皮質酮血癥導致的行為異常，并進一步研究發現這一藥理作用可能通過神經可塑性機制發揮作用，如興奮性氨基酸轉運、突觸可塑性、膠質細胞功能異常等[9-10]。Gao等[11]應用人參有效成分人參皂苷Rg2在動物實驗中獲得了相同的研究結果。以上臨床前研究與本文所獲得的研究結果相一致，都反映了人參具有防治PTSD的藥理作用，并且PTSD發病與神經遞質和突觸功能異常相關。臨床研究中通過對PTSD患者的辨證論治發現，有相當一部分患者表現為本虛標實，尤其對于患病時間較久的患者心膽氣虛和“恐傷腎”導致的腎氣虛為主要證型，臨床治療中采用補氣類中藥進行治療取得較好的治療效果[12-15]。通過本次網絡藥理學研究能夠為其提供現代藥理學基礎數據的支持。

本研究的意義在于：首先，研究結果從另一角度證實人參具有防治PTSD的藥理作用；其次，能夠解釋人參防治PTSD的不同機制出現的原因，是由于多成分多靶點所造成。最后，通過藥物靶點基因的綜合分析獲得了PTSD相關病理生理機制的信息，從這一角度出發可以進一步闡述PTSD發生發展的神經生物學機制，這也是神經藥理學重要的工作之一。然而，基于目前已知人參防治PTSD的文獻，本次網絡藥理學研究結果并沒有涵蓋所有已經被報道的人參藥用成分與作用靶點。造成這一情況的原因：一方面由于藥物成分入選的條件是根據中藥藥理學通行的研究經驗進行主觀設定與真實情況存在一定差異，可能導致具有潛在良好藥效的成分未入選。另一方面，大量相關研究僅僅停留在改善PTSD模型動物功能表型這一水平，而沒有涉及到作用靶點這一藥理學關鍵問題。因此，本研究的結果可能隨著相關數據庫的不斷完善和研究方法的不但進步發生變化。網絡藥理學研究方法本質上是基于數據庫對已有研究的總結歸納以及對具有潛在研究意義的工作預測，所以研究得到預測結果必須通過科學的實驗設計進行驗證。

綜上所述，本研究結果為進一步研究人參防治PTSD提供了依據和方向，尤其對人參有效成分治療本病的研究提供了備選成分和藥物靶標，兩者相結合進行實驗驗證可能獲得有意義的科學成果。