基于網絡藥理學探究積雪草酸抗酒精性肝炎的作用機制

陳思韻，馮鐘文，龐麗君，黃瑀莘，韋定一，孔令軍，何 赟，韋錦斌

(廣西醫科大學藥學院藥理學教研室,廣西 南寧 530021)

酒精性肝炎(alcoholic hepatitis，AH)作為酒精性肝病中的一種，是以黃疸和進行性炎癥性肝損傷為特征的臨床綜合征[1]，短期死亡率高[2]。在我國酒精性肝病已成為繼病毒性肝炎后的第二大肝病，而AH是肝病發展的重要演變過程，如果不進行干預，后續可能演變成肝纖維化、肝硬化和肝細胞癌[3]。目前臨床上對AH仍沒有理想有效的治療藥物[4]，由于其復雜的發病機制，大大限制了新藥的研發。因此，進一步研究和尋找有效的藥物進行治療，延緩甚至阻斷肝硬化和肝癌等肝臟疾病的發展與預后，具有十分重要的意義。

我們前期的研究中發現[5]，積雪草酸(asiatic acid，AA)可以通過降低內質網應激的程度而顯著改善高脂飼料誘導的脂肪肝疾病。然而，AA對AH的保護作用目前尚不清楚。網絡藥理學作為一種探索中醫藥干預疾病機制的方法，從生物分子網絡的結構與功能來認知中藥藥性[6]，將網絡生物學的思想和方法應用于中藥藥理學研究[7]。在一定程度上為探究AA是否作用于酒精性肝炎以及作用機制的研究，提供了一種新的思路。因此，本文通過網絡藥理的預測和體內大鼠實驗驗證的方法來探究AA對AH疾病的關鍵靶點及潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料SPF級，體質量(180±20) g，雄性SD大鼠購自廣西醫科大學動物中心(生產許可證：SCXK桂2014-0002)。本研究所有的動物護理和實驗程序均經廣西醫科大學動物倫理委員會批準。積雪草酸(純度>98%，廣西卓一生物技術有限公司)。水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司)；TNF-α試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；ADH、ALDH、GSH試劑盒(南京建成生物研究所)。

1.2 積雪草酸靶點預測用PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索積雪草酸的SMILES結構，分別輸入到STITCH(http://stitch.embl.de/)和SEA數據庫(http://sea.bkslab.org)的搜索欄中，檢索得到化合物積雪草酸的靶點數據。依托PharmMapper數據庫(http://lilab-ecust.cn/pharmmapper/)搜索關鍵詞“Asiatic acid”得到積雪草酸的預測靶點，3個數據庫得到的化合物預測靶點取并集為積雪草酸最終預測靶點。

1.3 酒精性肝炎靶點預測分別在OMIM數據庫(https://omim.org/)和GeneCards(人類基因信息數據庫http://www.genecards.org/)搜索關鍵詞“Alcoholic hepatitis”，下載疾病預測靶點數據，去除重復靶點，篩選出相關度高的靶點。

1.4 靶點相互作用網絡將疾病和化合物靶點進行比對，運用基迪奧生物網站(https://www.omicshare.com/)制作Venn圖，篩選出共同靶點。將共同靶點輸入到String數據庫(http://string-db.org/)中，限定物種為homo sapiens(智人)，獲得靶點相互作用網絡。

1.5 富集分析共同靶點將上述共有靶點輸入到Metascape數據庫(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)進行GO功能富集分析，再利用DAVID 6.8數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)對作用靶點進行KEGG代謝通路富集分析，制作DAVID富集分析圖，觀察通路與靶點相互作用的關系，查詢富集分析后的相關通路。

1.6 實驗分組與造模60只SD大鼠適應性喂養一周后隨機分為6組，分別為正常組(A組)、積雪草酸陰性對照組(B組)、模型組(C組)、水飛薊賓組(D組)、積雪草酸低劑量(E組)和積雪草酸高劑量組(F組)，每組各10只。C、D、E和F組每日灌胃給予階梯式改良[8]食用酒精灌胃法建立AH模型，即1-3周給予30%乙醇5.0 g·kg-1·d-1，4-6周35%乙醇6.0 g·kg-1·d-1，7-8周40%乙醇7.0 g·kg-1·d-1，9-10周40%乙醇8.0 g·kg-1·d-1，11-12周40%乙醇,9.0 g·kg-1·d-1，13-24周40%乙醇,10.0 g·kg-1·d-1。從13周至24周，B和F組灌胃積雪草酸8 mg·kg-1，E組灌胃積雪草酸4 mg·kg-1，D組灌胃水飛薊賓26.25 mg·kg-1，每日1次。治療結束后，所有大鼠麻醉處死，收集的血樣和肝臟組織均存于-80 ℃冰箱。

1.7 血清檢測AST和ALT活性大鼠腹主動脈取血于醫用10 mL采血管內，離心后取上清液，采用全自動血生化儀檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)和谷草轉氨酶(AST)血清水平，嚴格按照操作說明進行。

1.8 肝臟檢測ADH和ALDH活性[9]收集到的肝臟用生理鹽水進行清洗，以肝臟(mg) ∶生理鹽水(mL)按照1 ∶9的比例在玻璃勻漿器研磨肝臟組織直至無明顯組織碎屑的混懸液,離心取上清，制得的肝勻漿按照試劑盒說明書檢測乙醇脫氫酶(ADH)和乙醛脫氫酶(ALDH)活性。

1.9 肝臟檢測TNF-α和GSH活性將上述方法制得的肝勻漿按照腫瘤壞死因子α (TNF-α)和谷胱甘肽(GSH)試劑盒說明書進行操作。

1.10 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測肝組織中NF-κB信號通路蛋白的表達將大鼠肝臟從-80 ℃冰箱中取出，每組約取100 mg肝組織置于研缽中用液氮研磨至粉末，按照說明書加入蛋白裂解液(RIPA高效裂解液 ∶PMSF ∶蛋白酶抑制劑 ∶磷酸酶抑制劑=100 ∶1 ∶1 ∶1)制備勻漿離心后取上清液。用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度。取適量的蛋白質樣品在10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離，并使用濕轉移法轉移到PVDF膜上。轉移后，膜用TBST沖洗3次。后經p-IKKα/β、IKKα/β、p-IκBα、IκBα、NF-κB p65和p-NF -кB p65 (1 ∶1 000 Proteintech)一抗在4 ℃下過夜。全蛋白以GAPDH作為內對照。次日，用熒光標記的山羊抗兔IgG(1 ∶10 000 Licor)室溫避光孵育1 h，再TBST沖洗3次，后置于Odyssey紅外成像系統(LI-COR Bioscience, Lincoln, NE)中掃描，用ImageJ分析軟件進行密度掃描定量。

1.11 病理學檢查每只SD大鼠于肝左葉同一部位取大小約100 mg的肝組織，10%福爾馬林固定，石蠟包埋。每張切片厚度為5 μm，進行蘇木精-伊紅( HE)染色，在顯微鏡下觀察肝組織的病理變化。

2 結果

2.1 積雪草酸與酒精性肝炎靶點分別在PharmMapper數據庫搜索得到199個，SEA數據庫搜索得到21個和STITCH數據庫得到10個積雪草酸靶點，取并集后得到225個不同的積雪草酸預測靶點。Gencards數據庫中篩選評分在20以上的靶點，檢索到215個酒精性肝炎的潛在靶點，OMIM數據庫檢索到525個基因靶點，并集后得到696個酒精性肝炎預測靶點。

2.2 靶點相互作用網絡結果比對積雪草酸與酒精性肝炎預測靶點，篩選出共同靶點24個(Tab 1)。在基迪奧生物網站繪制Venn圖(Fig 1)。建立共同靶點相互作用網絡圖(Fig 2)。該網絡線條越粗表示靶點間的關聯度越大，圖中各靶點間關聯性較強，其中以CASP3、GRB2、ESR1、MET、STAT1、JAK2、EGFR的關聯性最強。提示這些靶點可能是積雪草酸對酒精肝炎發揮療效的關鍵靶點。

Tab 1 The overlapping targets of asiatic acid and alcoholic hepatitis

Fig 1 Venn diagram of asiatic acid and alcoholic hepatitis

Fig 2 Target interaction network diagram

2.3 富集分析結果Metascape和DAVID數據庫富集分析共同靶點，共得到12個GO功能條目(Fig 3)，20條KEGG信號通路(Fig 4)。可以發現GO功能中腺體發育和肌肉細胞凋亡過程的調控表達突出。hsa05200:Pathways in cancer 通路均排在Metascape和DAVID富集分析結果的第一位，且富集基因：STAT1、CDH1、CASP3、RARB、GRB2、PPARG、MET、MMP9、EGFR，均為關聯性較強的靶點基因，可以推測該通路對AH有一定的作用。Pathways in cancer通路的子通路眾多，NF-κB信號通路是Pathways in cancer通路的中心通路，可與多條子通路相連，且NF-κB信號通路是經典的炎癥通路[10]，其表達的升高往往能反映出肝細胞的炎癥和損傷程度。

Fig 3 Metascape enrichment analysis diagram

Fig 4 David enrichment analysis diagram

2.4 AA對AST和ALT活性影響AST和ALT是肝細胞內重要的功能酶，也是肝損傷程度最敏感的指標[11]。與正常組比較，模型組中大鼠血清AST及ALT活性顯著升高，水飛薊賓和AA治療后AST及ALT活性明顯降低，而AA對正常大鼠的AST及ALT活性幾乎沒有影響。研究表明，積雪草酸可以降低大鼠的肝損傷程度(Tab 2)。

Tab 2 Comparison of serum liver function indexes of

2.5 AA對ADH和ALDH活性影響ADH和ALDH是重要的酒精代謝酶。實驗結果顯示，與正常組大鼠比較，模型組中大鼠ADH和ALDH活性明顯降低，AA低劑量和高劑量組治療后ADH和ALDH活性明顯回升，而AA對正常大鼠 ADH和ALDH活性幾乎沒有影響。研究結果表明，積雪草酸可以提高酒精代謝酶的活力(Tab 3)。

Tab 3 Comparison of liver alcohol metabolism indexes of

2.6 AA對TNF-α和GSH活性影響與正常組大鼠比較，模型組中大鼠的TNF-α和GSH活性升高，水飛薊賓治療后的TNF-α和GSH活性降低至正常水平。AA 治療組以劑量依賴性的方式使TNF-α和GSH活性降低。AA對照組中TNF-α和GSH水平與正常組間無差異。結果表明，AA能減輕炎癥反應和氧化應激水平(Tab 4)。

Tab 4 Comparison of inflammatory factors and antioxidant stress indexes of

2.7 AA 對 NF-κB信號通路蛋白表達的影響NF-κB通路中各組蛋白相對表達量如Fig 5所示。實驗結果顯示，AH極大提高p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-кB p65的表達，模型組p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-кB p65的蛋白表達量明顯升高，水飛薊賓組和AA治療組治療后這種情況得到了抑制，并且AA治療組呈劑量依賴性的降低了NF-кB通路中各蛋白表達，而AA對照組則與正常組蛋白的表達幾乎無差異。結果表明，AA能抑制NF-κB信號通路中IKKα/β、IκBα和NF-кB p65蛋白的表達。

Fig 5 Effect of asiatic acid on protein expression of NF-κB pathway

2.8 肝組織病理組織學檢查H&E染色結果顯示，正常組和AA對照組中大鼠的肝細胞形態規則、排列緊密，呈放射狀有序排列，而模型組大鼠肝組織出現了細胞衰老退變和炎癥細胞浸潤甚至炎癥壞死等形態變化而水飛薊賓組和AA治療組中，炎癥細胞浸潤、細胞壞死等現象均明顯減輕(Fig 6)。

Fig 6 HE staining results of rats(×200)

3 討論

本文通過網絡藥理學分析的方法，預測積雪草酸與酒精性肝炎的關鍵靶點及其潛在的作用機制。篩選得到共同靶點24個，富集分析得到12個GO功能條目和21條KEGG信號通路，KEGG通路基因主要富集在Pathways in cancer通路上，且富集基因均為關聯性強的基因。網絡藥理學結果顯示，積雪草酸對酒精性肝炎具有一定的作用效果，并且積雪草酸可以通過多通路，多途徑作用于酒精性肝炎疾病，而NF-κB信號通路是其中一個重要的調節途徑。

大鼠體內實驗結果顯示，模型組的AST和ALT的數值異常偏高，說明肝損傷嚴重，GSH指標檢測結果顯示模型組大鼠的氧化應激水平異常。結合TNF-α指標檢測和病理結果顯示，模型組的促炎因子釋放增加，炎癥細胞浸潤明顯，說明以食用酒精灌胃誘導的酒精性肝炎模型成功。模型組的ADH和ALDH值明顯低于正常組，說明長期過量的飲酒可導致酒精代謝功能減退。水飛薊賓被稱為“天然的保肝藥”，可防止多種原因引起的肝損傷[12]。研究結果顯示，水飛薊賓治療組和AA高劑量治療組的療效幾乎等同。而水飛薊賓和AA治療后均能顯著降低AST、ALT、TNF-α和GSH水平，升高ADH和ALDH值，說明兩者都能有效地減輕肝組織的病理損傷，抑制促炎因子的釋放，減輕炎癥反應，并減少氧化應激功能，同時還能增強酒精代謝酶的活性。為了進一步探究AH的炎癥反應，基于網絡藥理學分析的結果，我們測定了NF-κB信號通路中的關鍵蛋白——IKKα/β、IκBα和NF-κB p65[13]。NF-κB是廣泛分布于細胞內的核轉錄因子，促進肝損傷過程中激活的主要炎癥通路，參與腫瘤的發展。IKKα/β的激活可促使IκBα磷酸化及降解過程，IκBα降解后會激活NF-κB，使NF-κB與IκBα結合形成的聚合物分離[14]。NF-κB表達的升高可引起炎性細胞因子的分泌與釋放，進而導致肝臟炎癥、纖維化、肝細胞壞死及凋亡等作用[15]。AA治療組以劑量依賴性的使p-IKKα/β、p-IκBα和p-NF-κB p65蛋白表達下調，說明AA治療組和水飛薊賓組可以抑制NF-κB通路中關鍵蛋白的表達。實驗結果提示，積雪草酸可能通過抑制NF-κB信號通路相關蛋白的表達，以此來抑制炎癥因子的表達，從而起到抗炎作用。

綜上所述，積雪草酸對酒精性肝炎疾病具有一定的治療作用，可以通過抑制NF-κB信號通路而改善肝損傷和炎癥反應。